大量的天然和非天然生物活性物質(zhì)分子中具有一個或多個哌啶環(huán)，包括許多市售的活性藥物成分。手性哌啶醇及其衍生物是制藥工業(yè)中重要的中間體，比如(S)-N-Boc-3-羥基哌啶(S)-NBHP)是合成依魯替尼藥物的關(guān)鍵手性中間體，其市售品名為Imbmvica，是一種靶向B細(xì)胞的抗癌藥物。依魯替尼已于2013年獲得美國食品和藥物管理局的批準(zhǔn)用于治療套細(xì)胞淋巴瘤，分別于2014年和2015年獲得批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤。目前手性哌啶醇主要是通過化學(xué)方法將原料通過多步轉(zhuǎn)化制備而得.產(chǎn)率和產(chǎn)品純度不理想同。最近，酮還原酶(KRED)催化N-Boc-3-哌啶酮(NBPO)的不對稱還原反應(yīng)在手性哌啶醇的合成中顯示出良好的性能。2014年通過商業(yè)KRED實現(xiàn)100g/LNBPO的生物轉(zhuǎn)化，首開醇脫氫酶合成(S)-NBHP的先河。然而，本篇研究中所采用的KRED及其后報道的醇脫氫酶均具有一定程度的底物抑制和產(chǎn)物抑制，且反應(yīng)需要添加昂貴的輔酶，不利于高濃度條件下實現(xiàn)酶法規(guī)?；苽?S)-NBHP。因此，篩選具有良好催化性能的醇脫氫酶(或酮還原酶)對實現(xiàn)高效酶法制備(S)-NBHP具有重要意義。

作者對本實驗室保存的還原酶庫進行了篩選,旨在獲得對NBP0具有優(yōu)良催化性能的還原酶。該酶庫中的還原酶具有20％～50％的氨基酸序列同源性，并能夠催化還原多種酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，來源Kluyveromycespolyspora的醇脫氫酶KpADH顯示出較大的潛力，適用于酶法不對稱合成(S)-NBHP?；趯Σ煌磻?yīng)體系的研究，解釋了產(chǎn)物抑制的主要因素，并通過不添加任何助溶劑的單水相體系解除了產(chǎn)物抑制的影響，實現(xiàn)了無需額外添加輔酶NADPH的條件下(S)-NBHP的高效和綠色合成。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

輔酶NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADP⁺(氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NAD⁺(氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)等：購于深圳邦泰生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、β-巰基乙醇、TEMED、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)等：購于上海捷瑞生物工程有限公司：N-Boc-3-羥基哌啶：購于上海麥克林生物公司：N-Boc-3-哌啶酮：購于上海皓伯化工有限公司。

1.2 菌株

所有質(zhì)粒均保存于江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物催化與酶工程實驗室還原酶文庫，并在Escherichia.coliBL21(DE3)中表達。

1.3 高通量活力測定方法

以NBP0作為底物，在30℃下測定340nm處NAD(P)H吸光度的變化，計算比活力。200μL活力測定體系包括：10μL粗酶液(適當(dāng)稀釋倍數(shù))，10μLNBPO(溶于乙醇，終濃度為5mmol/L)，10μLNAD(P)H(終濃度為1mmol/L)和170μL磷酸緩沖液(100mmol/L，pH7.0)。一個酶活力單位(U)定義為在上述條件下每分鐘氧化1μmolNAD(P)H所需的酶量。

1.4 分析方法

反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，并通過真空蒸發(fā)器揮發(fā)乙酸乙酯。采用高效液相色譜法(HPLC)分析立體選擇性及轉(zhuǎn)化率。立體選擇性分析采用SuperchiralS-AY柱(4.6mm×150mm，ShanghiraiChiralwayBiotechCo.Ltd)測定，流動相為體積分?jǐn)?shù)95％的正己烷和體積分?jǐn)?shù)5％的乙醇。轉(zhuǎn)化率分析使用C18柱(4.6mm×250mm，Diamonsil，ShanghaiDIKMACo.Ltd)，流動相為體積分?jǐn)?shù)55％的乙腈和體積分?jǐn)?shù)45％的水。檢測器波長均為210nm，柱溫為30℃。

1.5 蛋白質(zhì)的表達及純化

將含有KpADH重組質(zhì)粒的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，并加入50μg/mL的卡那霉素(Kan)，在37℃和180r/min下振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD₆₀₀達到0.8時，加入異丙基書-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，0.2mol/L)至終濃度0.2mmol/L。并將溫度降低至25℃誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。培養(yǎng)結(jié)束，通過離心收集細(xì)胞并在PBS緩沖液(pH7.4)中進行超聲破碎。將細(xì)胞裂解液以8000r/min離心30min。最后，通過親和色譜法純化細(xì)胞裂解液，并通過SDS-PAGE分析。

1.6 半衰期的測定

將KpADH的純酶液稀釋至1mg/mL左右，取稀釋的酶液1mL放入30℃恒溫水浴鍋中保溫。定時取樣并采用上述1.3的測活方法。以O(shè)h的活力為100％，依次測定比活力隨時間變化的曲線，活力下降到50％的時間為該蛋白質(zhì)在30℃的半衰期。

1.7 產(chǎn)物抑制動力學(xué)測定

采用純酶液測定硒ADH的動力學(xué)參數(shù)，使用上述1.3的測活方法，測定不同濃度底物(0.5～50mmol/L)和產(chǎn)物(0～100mmol/L)的比活力，使用0rigin軟件分別進行非線性回歸擬合。擬合方程包括：米氏方程、競爭性抑制方程、非競爭性抑制方程、反競爭性抑制方程、混合性抑制方程；并獲得參數(shù)抑制常數(shù)Ki、米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率V_max，采用0rigin評估擬合結(jié)果并通過MatLab軟件作圖。以上所有數(shù)據(jù)均獨立測定3次。

1.8 酶促不對稱合成反應(yīng)的條件優(yōu)化

反應(yīng)在20mL的磁力攪拌夾套反應(yīng)器中進行,將1g底物、1.2g葡萄糖、20mg葡萄糖脫氫酶凍干酶粉、35mgKpADH凍干酶粉及不同助溶劑分別加入10mL反應(yīng)體系中，30℃恒溫條件下反應(yīng)，并采用自動滴定儀滴定1mol/LNa₂CO₃，使pH維持在7.0。反應(yīng)進程中定點取樣，通過液相色譜分析獲得轉(zhuǎn)化率及終產(chǎn)物的對映體過量值(e.e.值)。

1.9 底物及產(chǎn)物分配系數(shù)的測定

準(zhǔn)確配制lmol/L的NBP0及NBHP，取20μL加入480μL緩沖液中，再按照體積比1：1加入有機溶劑，吸取200μL水相，加入400μL乙酸乙酯萃取并烘干，通過液相色譜分別計算出底物及產(chǎn)物的濃度。分配系數(shù)等于底物NBP0和產(chǎn)物NBHP分別在有機相和水相濃度的分配比。每個樣品分別做3個平行。

1.10 有機溶劑耐受性的測定

將純化的KpADH酶液(保持蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1mg/mL左右)與有機溶劑按體積比1:1混合，在30℃和1000r/min條件下振蕩并保溫12h，吸取水相中的酶液采用1.3的測活方法，進行殘余活力的測定。

1.11 克級制備(S)-NBHP

反應(yīng)在20mL的磁力攪拌夾套反應(yīng)器中進行，將2g底物、2.4g葡萄糖、40mg葡萄糖脫氫酶凍干酶粉、70mg腳ADH凍干酶粉分別加入10mL反應(yīng)體系中，30℃恒溫反應(yīng)，并采用自動滴定儀滴定lmol/LNa2C03，使pH維持在7.0。反應(yīng)結(jié)束后，采用二氯甲烷將反應(yīng)液萃取3次，收集萃取后的二氯甲烷，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)二氯甲烷，獲得產(chǎn)品(S)-NBHP。采用HPLC分析產(chǎn)品的立體選擇性。

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