骨質(zhì)疏松癥是一種以單位體積內(nèi)患者的骨量減少為主要特點(diǎn)的代謝性骨病，主要發(fā)生在中老年人群。疼痛是骨質(zhì)疏松患者的主要臨床表現(xiàn)，其次為身長(zhǎng)縮短、駝背、骨折及呼吸系統(tǒng)障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

乳清蛋白是利用現(xiàn)代工藝技術(shù)從牛乳中提取出來(lái)的一類蛋白質(zhì)，含有大量的免疫球蛋白、乳鐵蛋白等多種活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，在營(yíng)養(yǎng)學(xué)中被譽(yù)為“蛋白之王”，具有易消化、高生物利用率等優(yōu)點(diǎn)，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白補(bǔ)充劑。有實(shí)驗(yàn)研究表明，用乳清蛋白肽長(zhǎng)期喂養(yǎng)大鼠，能明顯增加大鼠的骨密度、骨礦物質(zhì)含量和骨骼的承載能力，提高骨骼抵抗骨折的能力，說(shuō)明乳清蛋白具有一定的抗骨質(zhì)疏松能力。

斑馬魚與哺乳動(dòng)物骨骼發(fā)育機(jī)制類似，該模型克服傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型耗時(shí)長(zhǎng)、效率差、靈敏度低、用藥量大的缺陷，克服原代骨細(xì)胞模型條件苛刻，操作復(fù)雜，作用環(huán)節(jié)單一等不足，為活性藥物篩選提供簡(jiǎn)單、高效新方法。

目前我國(guó)主要依靠進(jìn)口乳清蛋白，本研究以潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松為模型，對(duì)比研究進(jìn)口乳清蛋白粉與自提乳清蛋白粗提粉的抗骨質(zhì)疏松作用，以期為發(fā)展國(guó)產(chǎn)乳清蛋白產(chǎn)業(yè)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB斑馬魚（3dpf，南京一樹(shù)梨花公司）。

1.1.2 原料與試劑

進(jìn)口乳清蛋白粉（WPC-8800，美國(guó)HILMAR）；乳清粉（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司）；潑尼松龍（源葉生物，批號(hào)A1N15J11Q115595）；依替膦酸二鈉（源葉生物，批號(hào)K22A8M34493）；多聚甲醛（麥克林，批號(hào)C10476448）；茜素紅S染色液（源葉生物，批號(hào)L03D11G133270）；二甲基亞砜（源葉生物，批號(hào)Z26D11Y135891）；24孔培養(yǎng)板（美國(guó)CorningIncorporat）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）；FA1204B型精密電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白粗提粉的制備

乳清粉與超純水按10∶1的比例溶解，通過(guò)卷式膜組件，以PES（聚醚砜）超濾膜材料，選擇錯(cuò)流的超濾方式，切向流速選用的最大體積流量4L·min^-1、膜透壓為0.25Mpa、溫度為25℃為適宜的操作參數(shù)，獲得乳清蛋白粗提粉樣品。

1.2.2 主要藥物溶液的配制

1.2.2.1 潑尼松龍溶液

精密稱取潑尼松龍22.70mg，用培養(yǎng)基稀釋并定容至25mL得2500µmol·L^-1潑尼松龍儲(chǔ)備液；取該儲(chǔ)備液0.25mL用培養(yǎng)基稀釋并定容至25mL，得25µmol·L^-1潑尼松龍溶液。

1.2.2.2含潑尼松龍的依替膦酸二鈉溶液

精密稱取依替膦酸二鈉3.81mg，用培養(yǎng)基稀釋并定容至25mL，取該液2.5mL和0.25mL“2.1.1”中潑尼松龍儲(chǔ)備液，培養(yǎng)基稀釋并定容至25mL，得含潑尼松龍（25µmol·L^-1）的15µg·mL^-1依替膦酸二鈉溶液。

1.2.2.3 含潑尼松龍的F-WPC溶液

分別取0.5mL、0.25mL、0.125mL的100µg·mL^-1F-WPC溶液和0.5mL“2.1.1”中潑尼松龍儲(chǔ)備液，培養(yǎng)基稀釋并定容至50mL，得含25µmol·L^-1潑尼松龍的1µg·mL^-1，0.5µg·mL^-1，0.25µg·mL1F-WPC溶液。

1.2.2.4 含潑尼松龍的Z-WPC溶液

分別取0.5mL、0.25mL、0.125mL的10mg·mL-1Z-WPC溶液和0.5mL2500µmol·L^-1潑尼松龍儲(chǔ)備液，用培養(yǎng)基稀釋并定容至50mL，得含25µmol·L^-1潑尼松龍的100µg·mL^-1，50µg·mL^-1，25µg·mL^-1的Z-WPC溶液。

1.2.3 斑馬魚給藥劑量的選擇

選取健康的3dpf的魚卵均勻地分到24孔板中，每孔5枚魚卵。將F-WPC溶液、Z-WPC溶液5個(gè)濃度1000、100、10、1、0.1µg·mL^-1，分別加入到相應(yīng)的孔中，每孔1mL溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于24，48，72hpf觀察胚胎的死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡率并繪制累計(jì)死亡率曲線。

1.2.4 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立及分組

根據(jù)“1.2.3”實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為使幼魚盡可能存活至9dpf，給藥期間選擇72h內(nèi)大于90%存活率的濃度作為最高給藥濃度，即1µg·mL^-1F-WPC溶液、100µg·mL^-1Z-WPC溶液，設(shè)置高中低3個(gè)劑量組。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、依替膦酸二鈉（15µg·mL^-1）組、1µg·mL^-1、0.5µg·mL^-1、0.25µg·mL^-1F-WPC組以及100µg·mL^-1，50µg·mL^-1，25µg·mL^-1的Z-WPC溶液組。將3dpf的斑馬魚幼魚小心移至24孔板中，每孔5條，3孔為一組。每孔加入相應(yīng)的溶液1mL，所有組每24h更換一次溶液，直到斑馬魚發(fā)育到9dpf。

1.2.5 斑馬魚骨骼的茜素紅染色

將9dpf的幼魚置于MS-222（200mg·L^-1）中麻醉致死后固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液3h，再將斑馬魚幼魚置于50%乙醇中處理10min；去除乙醇后加入茜素紅染色液，放置過(guò)夜；第二天去除染色液，加入超純水洗去多余的染液，再加入新鮮配制的漂白劑（含1%KOH和1.5%H₂O₂），放置2h；去除漂白劑后，逐步以比例為3∶1，1∶1和1∶3的0.5%KOH和甘油的混合溶液各處理6h，最終保存于純甘油中。采用Imageproplus6.0軟件處理熒光倒置顯微鏡采集放大100倍的顯微成像圖，計(jì)算斑馬魚頭骨染色面積和累積光密度（分別代表斑馬魚頭骨礦化面積與骨密度）。n=6，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，并通過(guò)t-test比較各組的差異。

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