2.5 冷激蛋白的結(jié)構(gòu)分析

為更好了解冷激蛋白潛在的生物功能，分析其蛋白的空間結(jié)構(gòu)。將水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到PSＩPRED預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。典型的冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含5個β折疊，預(yù)測得到的二級結(jié)構(gòu)與這個結(jié)果大致相符，Csp1589和Csp1376二級結(jié)構(gòu)的最后一個β折疊出現(xiàn)斷層，這可能是天冬酰胺預(yù)測可信度太低所致。

將冷激蛋白的氨基酸序列提交SWＩSS-MODEL網(wǎng)站，根據(jù)序列相似性及模型質(zhì)量分別選取1mjc的A鏈、5xv9的A鏈、3i2z的B鏈作為Csp1589、Csp1376和Csp2252的模板建模。然后，用PROCHECK和verify3D對所建三級模型進行質(zhì)量評估。構(gòu)建的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白三級結(jié)構(gòu)都包含5個反向平行的β鏈，其形成了一個桶狀結(jié)構(gòu)，符合冷激蛋白的已知特征。由拉氏構(gòu)象圖可看出，對于Csp1589蛋白模型，氨基酸處于有利區(qū)域、額外允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的量分別為88.9%，11.1%，0%和0%。對于Csp1376型蛋白模型，對應(yīng)值分別為92.7%，7.3%，0.0%和0.0%。對于Csp2252型蛋白模型，對應(yīng)值分別為96.1%，3.9%，0.0%和0.0%，氨基酸全部處于有利區(qū)域和額外允許區(qū)域，模型質(zhì)量較好。在Ｖerify3D結(jié)果中，對于Csp1589、Csp1376和Csp2252模型，平均分≥0.2的氨基酸的量分別是和100%，89.86%和100%，平均分≥0.2的氨基酸的量達到80%就認為蛋白三級模型是合格的，因此，以verify3D結(jié)果來看，這3個模型均具有較好的質(zhì)量。

2.6 冷激蛋白的互作蛋白及配體結(jié)合位點分析

利用STRＩNG和COACH網(wǎng)站對腐敗希瓦氏菌冷激蛋白進行分析，得到如圖6所示與其緊密作用的蛋白質(zhì)和潛在的配體結(jié)合位點。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252，STRＩNG分別檢測到5，4，10個與其相互作用的蛋白（圖6）。與冷激蛋白Csp1589存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、甲基轉(zhuǎn)移酶（ABP75296.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侶蛋白（htpG）。與冷激蛋白Csp1376存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侶蛋白（htpG）。與冷激蛋白Csp2252存在相互作用的蛋白是依賴ATP的Clp蛋白酶（ABP75948.1）、依賴ATP的Clp蛋白酶適配蛋白（ClpS）、組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、組氨酸磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶（hisC）、磷酸庚糖異構(gòu)酶（gmhA）、含有CBS結(jié)構(gòu)域的蛋白（ABP76571.1）、氮調(diào)控蛋白PtsN（ABP74443.1）、伴侶蛋白（htpG）。其中組氨酸激酶是一個磷酸化組氨酸保守殘基的信號傳導(dǎo)酶家族，參與構(gòu)成雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)可以感應(yīng)環(huán)境變化，應(yīng)對環(huán)境變化引起的負面效應(yīng)，研究表明一些雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了細菌的低溫適應(yīng)過程，推測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白與細胞對逆境的適應(yīng)有關(guān)。DNA聚合酶是DNA復(fù)制的重要酶，冷激蛋白可能與DNA復(fù)制有關(guān)。冷激蛋白作為一種伴侶蛋白，可能與伴侶蛋白htpG存在競爭關(guān)系。從分析結(jié)果可推測相較Csp1589和Csp1376，腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp2252的功能可能更為復(fù)雜。在許多重要的生命活動中，蛋白質(zhì)功能的執(zhí)行依賴于蛋白質(zhì)與配體的相互作用，對于蛋白質(zhì)配體結(jié)合位點的預(yù)測具有重要的意義。例如：把小分子放到目的蛋白的配體結(jié)合位點，優(yōu)化配體構(gòu)象和位置，使之和目的蛋白有最佳的結(jié)合作用，就有可能發(fā)現(xiàn)抑制該蛋白的化合物。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252，其分別預(yù)測到2，2，1個可能性較高的配體結(jié)合位點（圖6）。

3 結(jié)論

冷激蛋白是解析細菌低溫適應(yīng)的關(guān)鍵蛋白之一。本研究成功擴增了水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個冷激蛋白基因，并對其進行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能方面的相關(guān)進展。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均為親水的小分子酸性蛋白質(zhì)，皆位于細胞質(zhì)，為非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克結(jié)構(gòu)域，存在DNA結(jié)合位點和RNA結(jié)合基序（motif），能與單鏈DNA和單鏈RNA結(jié)合。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376與大腸桿菌冷激蛋白CspA親緣關(guān)系較近，可能在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中起重要作用。冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均符合冷激蛋白家族的特征，其可靠的三級模型可用于各種對接和藥物靶向研究。通過蛋白互作和配體結(jié)合位點的分析，對其功能有更深的了解，為后續(xù)驗證冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中的功能，以及水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌冷激蛋白抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。

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