鹽漬辣椒制作過程中常添加15%以上的食鹽，0.05%～0.1%的CaCl2及0.05‰～0.1‰的焦亞硫酸鈉，因此該類辣椒保藏時間較長，且能保持較脆的辣椒口感，是剁辣椒加工過程中一類原料。鹽漬辣椒的質(zhì)量好壞，直接影響中、低鹽再加工品的質(zhì)量和安全。近年來，鹽漬辣椒的標準化生產(chǎn)，中、低鹽再加工品的提質(zhì)以及鹽漬辣椒的微生物多樣性等逐漸引起從業(yè)人員的重視。

現(xiàn)階段微生物多樣性研究報道多集中在環(huán)境土壤湖泊等領(lǐng)域，而食品方向以釀酒領(lǐng)域居多，發(fā)酵蔬菜類以韓國泡菜居多，而發(fā)酵辣椒多樣性研究鮮見。454焦磷酸測序技術(shù)測序已成熟應(yīng)用到微生物菌落鑒定中，能有效分析出樣品生態(tài)環(huán)境中原始微生物的組成及其比重。趙玲艷等研究發(fā)現(xiàn)線椒自然發(fā)酵過程中的真菌可歸屬到39個屬、56個種，優(yōu)勢真菌為漢遜酵母屬，米椒自然發(fā)酵過程中的真菌可歸屬到60個屬、96個種，優(yōu)勢真菌為漢遜酵母屬和畢赤酵母屬。

本研究采用454焦磷酸測序技術(shù)研究鹽漬辣椒中真菌多樣性，以確定鹽漬辣椒中真菌群落結(jié)構(gòu)及相對豐度。在此基礎(chǔ)上，研究鹽漬辣椒細菌多樣性，分析高鹽腌漬辣椒過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及相對豐度的變化，為安全生產(chǎn)腌漬辣椒，保障產(chǎn)品質(zhì)量，提高風(fēng)味提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

鹽漬米椒（C.annuumL.var.dactylusM）、鹽漬線椒（C.annuumL.var.conoidesＩrish），湖南壇壇香食品科技有限公司。

1.2 主要試驗試劑

E.Z.N.A.SoilDNA試劑盒、TransStartFastpfuDNA聚合酶、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、RocheGSFLXTitaniumemPCR試劑盒、Manual_XLR70試劑盒，美國OmegaBio-Tek公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DYY-6C型凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmpR9700型PCR儀，美國ABＩ；QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)，美國Promega；RocheGSFLX測序儀，瑞士Roche。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集

本研究以鹽漬線椒及鹽漬米椒為對象，選擇色澤、風(fēng)味較好的樣品，無菌操作取樣帶回實驗室，-80℃冰箱保存。

1.4.2 理化指標的測定

總酸：參照GB/T12456-2008測定；NaCl：參照GB/T12457-2008測定；水分：直接干燥法測定；辣椒素：參照GB-T21266-2007測定。

1.4.3 樣品中微生物DNA的提取

參照OMEGA公司E.Z.N.ASoilDNA試劑盒抽提方法提取DNA。

1.4.4 擴增產(chǎn)物定量及測序

正反向引物（27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，533R5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），帶有5’端454測序A、B接頭的特異引物和3’端的融合引物，其中A為測序端，需要加上條碼（barcode），B端引物可以共用。PCR采用20μL反應(yīng)體系。

1.4.5 PCR產(chǎn)物定量、測序

PCR產(chǎn)物熒光定量，要求總量＞100ng，要求PCR產(chǎn)物濃度>5ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0左右，未降解，根據(jù)454RocheGS-FLX測序。

1.4.6 生物信息分析方法

數(shù)據(jù)采取Qiime軟件去雜，生物信息學(xué)分析以去除嵌合體、分類學(xué)分析、OTU聚類、比對分析等。計算α多樣性指數(shù)后，進行群落結(jié)構(gòu)組分、繪制熱圖（Heatmap）、PCA分析、豐度等級（Rank-Abundance）和多樣性（Shannon-Wiener）曲線繪制等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽漬米椒和線椒的理化指標測定結(jié)果

鹽漬米椒和鹽漬線椒的辣椒素、水分、總酸、食鹽含量的變化見表1。從表1可以看出，鹽漬米椒的辣椒素含量為26120SHU，水分含量為65.10%，總酸含量為0.82%，食鹽含量為14.48%；鹽漬線椒的辣椒素含量為2412SHU，水分含量為73.18%，總酸含量為0.15%，食鹽含量為21.61%。

2.2 鹽漬線椒和米椒細菌和真菌的稀疏性曲線

鹽漬線椒和鹽漬米椒細菌和真菌的稀疏性曲線見圖1。由圖1可以看出，當細菌測序量增加到5000，真菌測序量增加到2000左右時，測序數(shù)據(jù)達到飽和，試驗設(shè)定細菌10000條序列、真菌5000條序列的測序深度是合理的。鹽漬線椒細菌和真菌稀疏性曲線分別比鹽漬米椒細菌和真菌的稀疏性曲線陡、高，鹽漬線椒的細菌和真菌多樣性分別高于鹽漬米椒的細菌和真菌多樣性。

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