云南松（Pinusyunnanensis）系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物，主要分布于我國四川、云南、廣西等地區(qū)。作為松屬植物重要的林產(chǎn)品之一，松針精油近年來受到廣泛關(guān)注和研究。其揮發(fā)油中主要含有α-蒎烯、β-蒎烯等萜烯類成分，具有明顯的鎮(zhèn)咳和祛痰作用，并有抗真菌、細菌和抗腫瘤活性。國內(nèi)種植的云南松、濕地松、油松、前紅松、加勒比松、云南松、華北落葉松等松樹種類的松針揮發(fā)油的成分研究已有報道，研究結(jié)果表明其組分及含量可因地域、樹種、生長環(huán)境、采收季節(jié)和提取方法的不同而有一定差異。云南松科植物資源豐富，主要海拔多為600～2100m地區(qū)，本文開展云南松針精油提取和抗氧化活性研究，探索共水法提取松針精油的最佳工藝，對于云南松的綜合利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：云南松新鮮針葉，采于云南省保山市隆陽區(qū)，經(jīng)保山學(xué)院汪建云教授鑒定系云南松（Pinusyunnanensis）的針葉，清水洗凈，曬干備用。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：合肥博美生物科技有限公司；過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、三氯化鐵、水楊酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；30％的H₂O₂、氯化亞鐵：天津市巴斯夫化工有限公司；結(jié)晶紫、草酸銨、抗壞血酸、氫氧化鈉：西隴科學(xué)股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UV2600）：日本島津；氣相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TRACEDSQ）：賽默飛世爾科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化；TDL-4低速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；PE30酸度計：梅特勒-托利多。

1.3 方法

1.3.1 云南松針精油的提取方法

稱取100g2～3mm小段的云南松針葉（鮮葉），置于1000mL圓底燒瓶中，按料液比加入含有NaCl的蒸餾水，浸泡3h，再共水蒸餾，收集玻璃分水器中的上層精油，并用無水NaSO₄干燥，過濾，得無色透亮云南松針精油，于4℃下保存，備用。出油率%=精油質(zhì)量（g）/鮮云南松針質(zhì)量（g）×100%。

1.3.2 單因素試驗

以出油率為指標，分別考察NaCl用量、料液比、提取時間和浸泡時間4個因素對松針精油出油率的影響。設(shè)定NaCl用量為6%，料液比為1:6g/mL，提取時間為3h，浸泡時間為2h，固定其它條件，分別考察NaCl用量（0%、2%、4%、6%、8%、10%），料液比（1:3、1:4、1:5、1:6、1:7g/mL），提取時間（1、2、3、4、5h），浸泡時間（0、1、2、3、4h）對出油率的影響。

1.3.3 正交實驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇NaCl用量（A）、料液比（B）、提取時間（C）和浸泡時間（D）四個因素進行L₉（3⁴）正交實驗，優(yōu)化松針精油的提取工藝（見表1）。

1.3.4 云南松針精油GC-MS測定

采用GC-MS對云南松針精油進行成分分析。氣相色譜條件為：色譜柱：型號DB-17，規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm；載氣為He，進樣口溫度：230℃；流量：1.0mL/min。升溫程序：起始50℃，保持4min；5℃/min升溫到70℃；20℃/min升溫到120℃；10℃/min升溫到170℃；5℃/min升溫到200℃；40℃/min升溫到280℃。質(zhì)譜條件為離子源：EI，電離能70eV，離子源溫度：200℃。

1.3.5 云南松針精油的理化性質(zhì)測定

松針精油折光指數(shù)的測定：GB/T14454.4-2008；旋光度的測定：GB/T14454.5-2008；相對密度的測定：GB/T14455.4-2008。

1.3.6 云南松針精油的抗氧化活性測定

1.3.6.1 松針精油的總抗氧化活性（ABTS法）

準確配制7.40mmol/L的ABTS和2.60mmol/L的過硫酸鉀試劑，按1:1體積比混合均勻，室溫下避光放置12～16h，得ABTS⁺自由基儲備液。在734nm處，用無水乙醇將ABTS⁺自由基儲備液稀釋至吸光度0.7±0.02，于4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。準確移取3.9mLABTS⁺自由基溶液，加入不同質(zhì)量濃度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松針精油（無水乙醇作溶劑），混合均勻后在室溫下避光靜置3.5h，于734nm處測定吸光度AE，以維生素C為對參照。以相同體積的無水乙醇作對照，測定吸光度AB。ABTS⁺自由基的清除率為：ABTS⁺·清除率%=（A_B-AE）×100%/A_E。

1.3.6.2 松針精油對DPPH·的清除能力

準確配制25.60mg/L的DPPH溶液（無水乙醇作溶劑），準確移取3.90mL，加入0.1mL不同濃度（102.20、51.10、25.50、12.75、6.38、3.19mg/mL）的松針精油，混合均勻，室溫避光反應(yīng)30min后，于波長517nm處測定吸光度A_i，無水乙醇作對照，測得吸光度Ac，同時測定3.90mL的無水乙醇中加入0.1mL不同濃度的松針精油混合液的吸光度A_j，并以維生素C為對照。

DPPH自由基的清除率為：DPPH·清除率%=

1.3.6.3 松針精油對OH·的清除能力（結(jié)晶紫法、水楊酸法）

結(jié)晶紫法：在7支20mL比色管中分別加入0.3mL結(jié)晶紫（0.4mmol/L），1.2mLFeSO₄溶液（1mmol/L）和0.6mLH₂O₂溶液（2.0mmol/L），混勻后用pH=4.0的緩沖溶液定容至10mL，搖勻，放置30min后，在580nm處測吸光度值A(chǔ)b，同樣的方法測定不加H₂O₂時580nm處的吸光度A₀。則羥自由基的產(chǎn)生量可以用ΔA=A₀-A_b來表示。表觀抗羥自由基氧化率的測定方法：在加H₂O₂之前分別加入1mL不同濃度的松針精油（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL），測定其吸光度As，并以維生素C為對照，則表觀抗羥自由基氧化率S可以按下式計算：S=（As-Ab）×100%/（A₀-A_b)。

水楊酸法：向比色管中加入2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mL1.0mmol/LH₂O₂溶液，震蕩均勻，于517nm處測得吸光度為A參比；再加入6.0mmol/L水楊酸3.0mL，搖勻后于37℃水浴15min，測定其吸光度為A_對照；在測得A參比后向比色管中加入不同濃度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松針精油2.0mL，搖勻后，室溫避光放置30min，測其吸光度為A_樣參；向比色管中加入2.0mL0.02mol/LFeSO₄溶液、2.0mLH₂O溶液，吸光度值為A_樣品。清除率的計算公式為：

OH·清除率%=

1.3.6.4 松針精油對Fe3+的還原能力（普魯士藍法）

在2.5mLpH=6.6的磷酸鹽緩沖液中依次加入不同質(zhì)量濃度（20.40、10.20、5.10、2.55、1.28、0.64mg/mL）的松針精油2.5mL，質(zhì)量分數(shù)為1％的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合均勻后在50℃恒溫20min，冷卻，再加入2.5mL質(zhì)量分數(shù)為10％的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL，加蒸餾水5mL和質(zhì)量分數(shù)0.1％FeCl3溶液1.0mL，避光靜置12小時后，在波長700nm處測定吸光度，并以維生素C為對照。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，采用excel、origin9.5軟件作圖，SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析。

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