油菜（BrassicanapusL.）屬于蕓薹科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica），是我國(guó)主要的油料作物。隨著2015年國(guó)家油菜籽臨時(shí)收儲(chǔ)政策的取消以及國(guó)外進(jìn)口沖擊的影響，油菜生產(chǎn)的比較效益嚴(yán)重下降，在很大程度上影響了我國(guó)農(nóng)民種植油菜的積極性。甘藍(lán)型油菜是由甘藍(lán)和白菜經(jīng)過(guò)自然雜交后再加倍后形成的，其兩個(gè)祖先都是深受廣大消費(fèi)者喜歡的可口蔬菜，從起源與進(jìn)化的角度來(lái)看，將油菜開(kāi)發(fā)為蔬菜具有良好的科學(xué)基礎(chǔ)和巨大的潛力。近年來(lái)在浙江、湖北、湖南、江蘇等長(zhǎng)江流域主產(chǎn)區(qū)，因地制宜總結(jié)出“菜用+油用”、“菜用+花用+油用”等多種油菜高效利用開(kāi)發(fā)模式。有研究表明，在適當(dāng)?shù)姆N植條件下，收獲油菜薹后并不會(huì)對(duì)油菜籽的產(chǎn)量造成顯著影響，此模式可有效增加農(nóng)民種植油菜的生產(chǎn)效益。在長(zhǎng)江流域油菜主產(chǎn)區(qū)，油菜作為冬季作物，不會(huì)影響到主要糧食作物的種植。利用冬閑田種植油菜，采用油蔬兩用技術(shù)(即先割菜薹，后收菜籽)，對(duì)提升油菜種植的整體效益，增加農(nóng)民收入，促進(jìn)我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

油菜幼苗（5葉期）以及油菜薹中都含有豐富的維生素C以及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用價(jià)值。培育高維生素C油菜薹品種，既可提升油菜薹的菜用價(jià)值，也可為消費(fèi)者提供健康營(yíng)養(yǎng)的功能型蔬菜。維生素C又稱(chēng)為抗壞血酸，是人體必需的主要維生素之一。對(duì)于一個(gè)普通成年人，人體所需的絕大多數(shù)其它維生素膳食推薦供應(yīng)量都在20mg/d以下，而維生素C的膳食推薦供應(yīng)量卻為100mg/d，是人體中需求量最大的一種維生素，當(dāng)人體嚴(yán)重缺乏維生素C時(shí)會(huì)引起壞血病，還會(huì)造成人體免疫力的下降。維生素C是蔬菜和水果中最常見(jiàn)的抗氧化劑，參與人體內(nèi)的多種氧化還原反應(yīng)。有研究表明，維生素C不僅可以預(yù)防癌癥，減少癌癥的發(fā)生率，還可以改善和提高人體的免疫功能，同時(shí)具有預(yù)防心血管疾病的重要功能。人體自身無(wú)法合成維生素C，必須要從新鮮的蔬菜、水果等食物中獲取。準(zhǔn)確并快速地測(cè)定出食物中的維生素C含量，對(duì)保證人體日常維生素C的攝取具有重要意義。

目前測(cè)定食物中維生素C含量的檢測(cè)方法主要有：碘酸鉀滴定法、熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等，但大多操作繁瑣、測(cè)定效率不高等問(wèn)題。在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB5009.86-2016中規(guī)定了高效液相色譜法、熒光法、2,6-二氯靛酚滴定法為測(cè)定食品中抗壞血酸的方法，其中2,6-二氯靛酚滴定法，操作簡(jiǎn)單，但是如果樣品中有色素等物質(zhì)會(huì)對(duì)滴定結(jié)果造成影響；熒光法耗時(shí)較長(zhǎng)；而高效液相色譜法是一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。但目前國(guó)標(biāo)中的高效液相色譜法采用的樣品前處理比較繁瑣，一個(gè)樣品從處理到上機(jī)檢測(cè)至少需要15min，測(cè)定效率不高。在對(duì)大群體樣本的維生素C進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如何快速并準(zhǔn)確篩選出高維生素C含量材料，提高維生素C檢測(cè)方法的效率就顯得尤為重要。

維生素C是一種水溶性維生素，分子式為C₆H₈O₆，分子中相鄰的兩個(gè)羥基極易發(fā)生分解并釋放出H⁺，呈酸性并具有很強(qiáng)的還原性，導(dǎo)致維生素C極其不穩(wěn)定。況且維生素C在常溫條件下易降解，樣品的貯藏條件影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此本研究在國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上優(yōu)化了測(cè)定維生素C的高效液相色譜法，改進(jìn)后的方法可快速準(zhǔn)確地測(cè)定樣品中維生素C的含量，同時(shí)利用液氮貯藏并研磨油菜樣品，使得該方法可操作期長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好、精確靈敏、回收率高，能長(zhǎng)期保存，可用于大群體樣本中維生素C的分析鑒定及遺傳解析，為進(jìn)一步研究油菜中維生素C的合成和遺傳機(jī)制奠定了方法基礎(chǔ)，有利于培育富含維生素C的油菜新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年10月至11月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所陽(yáng)邏試驗(yàn)基地所取的油菜幼苗（甘藍(lán)型油菜關(guān)聯(lián)群體材料，取樣時(shí)期為播種后30d左右）以及小白菜（兔子腿矮腳黃）、生菜（意大利全年耐抽薹生菜）、菠菜（大圓葉菠菜）（每種蔬菜的取樣時(shí)間均處于可食用狀態(tài)）。每種油菜選擇5株大小相近的材料（去掉油菜的根部和部分黃葉），小白菜、生菜、菠菜同樣各取大小相近的5株（去掉蔬菜的根部和部分黃葉）。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀（e2695，美國(guó)Waters公司）、PDA檢測(cè)器（2998，美國(guó)Waters公司）、色譜柱（C18柱，柱長(zhǎng)250nm，內(nèi)徑4.6nm，粒徑5μm，美國(guó)Waters公司）、瓶口分液器（5-50mL，德國(guó)Eppendorf公司）、萬(wàn)分之一天平（JJ124BC，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）、十萬(wàn)分之一天平（AUW220D，日本島津公司）、均質(zhì)機(jī)（AD500S-P，上海昂尼儀器有限公司）、超聲波清洗機(jī)（SB25-12DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）、真空抽濾裝置（DET-01P，達(dá)爾拓公司）、多功能粉碎機(jī)（JYS-M01，九陽(yáng)股份有限公司）。

鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、超純水（色譜純，Rephile-watersystem)、維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%以上，德國(guó)Sigma-Aldrich公司）、乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Sigma-Aldrich公司）、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）。
尼龍66（Nylon）濾膜（直徑25mm、孔徑0.45μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、尼龍66（Nylon）濾膜（直徑13mm、孔徑0.22μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、微孔水相濾膜（直徑50mm、孔徑0.25μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、2mL色譜進(jìn)樣瓶（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、內(nèi)插管（250μL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

提取液（1%HCl溶液）的配制：用移液槍吸取10mL鹽酸（優(yōu)級(jí)純）于1000mL容量瓶中，加超純水定容，搖勻后備用。
流動(dòng)相（20mmol/L的乙酸銨）：用萬(wàn)分之一的天平稱(chēng)取1.54g乙酸銨，溶解于200mL的超純水中，超聲15min后，再用超純水定容至1000mL后繼續(xù)超聲脫氣15min。超聲結(jié)束后用真空抽濾泵過(guò)微孔水相濾膜（0.22μm）進(jìn)行抽濾，過(guò)濾后的溶液裝入流動(dòng)相瓶中備用。為避免因流動(dòng)相的原因影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，20mmol/L的乙酸銨需現(xiàn)配現(xiàn)用。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/mL)：用十萬(wàn)分之一的天平準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g維生素C標(biāo)準(zhǔn)品于100mL棕色容量瓶中，用1%的鹽酸溶解并定容，充分搖勻后放置在4℃冰箱中避光保存。

1.3.2 鮮樣品的前處理

用萬(wàn)分之一的天平準(zhǔn)確稱(chēng)取2g新鮮油菜或蔬菜樣品的葉片，置于50mL離心管中，并加入40mL提取液（即1%的HCl），用均質(zhì)機(jī)將樣品完全均質(zhì)破碎。用5mL注射器吸取已均質(zhì)的樣品勻漿，過(guò)兩層濾膜（0.45μm+0.22μm），濾液過(guò)濾到250μL的內(nèi)插管中，待上機(jī)檢測(cè)。

樣品儲(chǔ)存：將新鮮油菜或蔬菜樣品分別貯藏在4℃、-20℃、液氮（-196℃）條件下。3d后，將貯藏在4℃、-20℃的一部分樣品放入液氮中速凍，用多功能粉碎機(jī)磨成粉末狀（用之前先用液氮進(jìn)行預(yù)冷），并置于50mL離心管中；剩余樣品不進(jìn)行研磨處理，直接稱(chēng)取2g樣品，其它處理方法和檢測(cè)方法相同。測(cè)定出不同貯藏條件以及不同處理方式下油菜和蔬菜樣品中維生素C的含量。

1.3.3 高效液相色譜儀（HPLC）的檢測(cè)條件

色譜柱，美國(guó)WatersXBridge-C18色譜柱；流動(dòng)相，甲醇和20mmol/L乙酸銨（兩者比例為7:93）；流速，1.0mL/min；進(jìn)樣量，10μL；目標(biāo)柱溫，25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，245nm；維生素C的保留時(shí)間，2.7min。

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