2.5 白菜型油菜srb多室候選基因的轉(zhuǎn)基因功能互補驗證

構(gòu)建Brclv3_Asp12等位基因的超量表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變體。獲得的大部分轉(zhuǎn)基因株系仍都表現(xiàn)為clv3-2的突變表型，包括莖扁平、花序莖頂端分生組織顯著增大和角果全部為多室等(圖4-i～n)。本研究也發(fā)現(xiàn)，5個獨立的轉(zhuǎn)化家系都能夠部分恢復clv3-2突變體的表型，包括部分角果表現(xiàn)為兩室(圖4-c，d)和較為正常的花序頂端分生組織(圖4-o，p)；未發(fā)現(xiàn)能夠完全恢復clv3-2突變表型的轉(zhuǎn)基因植株。在這些部分恢復的轉(zhuǎn)基因家系中BrCLV3基因表達量較clv3-2都顯著增加(圖4-s)。統(tǒng)計分析表明，它們的心皮數(shù)都較clv3-2顯著減少，但是都未能恢復到野生型的水平(圖4-t)。表明Brclv3_Asp12等位基因與已報道的BrCLV3功能類似，仍然具有參與莖頂端分生組織大小及多室角果發(fā)育調(diào)控的作用，只是功能有所減弱。因此Brclv3_Asp12中的組氨基酸/天冬氨酸突變可以引起B(yǎng)rCLV3等位基因的部分功能喪失，從而導致多室角果的產(chǎn)生。

2.6 白菜型油菜srb中多室候選基因的體外多肽處理驗證

為了進一步明確srb中Brclv3_Asp12等位基因變異對其產(chǎn)物的活性影響，本研究針對CLEmotif序列合成了野生型多肽BrCLV3和突變型多肽Brclv3_Asp12，并對擬南芥clv3-2突變體和野生型Ler進行了體外處理。

在液體培養(yǎng)條件下，對擬南芥幼苗的SAM大小進行了測量。經(jīng)野生型多肽BrCLV3處理后，擬南芥clv3-2突變體的SAM面積顯著減小(圖5-b，d，e)，與野生型Ler對照在未處理時的SAM面積無顯著差異(圖5-a，d，e)；表明BrCLV3多肽具有抑制莖頂端分生組織生長的活性，通過添加外源BrCLV3多肽可以將clv3-2突變體中增大的SAM恢復到野生型的狀態(tài)。在Brclv3_Asp12多肽處理條件下，clv3-2突變體的SAM面積也顯著減小，但仍極顯著大于BrCLV3多肽處理下的clv3-2突變體以及未處理的野生型Ler(圖5-a～e)；表明Brclv3_Asp12中的組氨基酸/天冬氨酸突變可以引起CLV3多肽活性的部分喪失，使其不能正常調(diào)控莖頂端分生組織的生長。

前期研究表明，野生型多肽BrCLV3也能顯著抑制根系生長。因此，我們在固體培養(yǎng)基上檢測了不同多肽處理濃度條件對擬南芥的根長及根頂端分生組織(rootapicalmeristem，RAM)生長的影響。在1nmolL-1BrCLV3多肽或Brclv3Asp12多肽處理條件下，擬南芥的主根長或RAM大小相對于未添加多肽的對照處理無顯著差異(圖6-a～c，h～j，o，p)。在10nmolL-1多肽處理條件下，Brclv3Asp12多肽處理條件下的擬南芥主根長或RAM大小與未添加多肽的對照處理間無顯著差異(圖6-a，d，h，k，q，r)；但是BrCLV3多肽處理會顯著抑制擬南芥主根或RAM生長(圖6-a，e，h，l，q，r)。在100nmolL-1多肽處理條件下，BrCLV3和Brclv3Asp12多肽處理均會極顯著抑制擬南芥主根或RAM生長(圖6-f，g，m，n，s，t)。該結(jié)果進一步證實srb中的Brclv3Asp12具有較低的多肽活性。

3 討論

很多研究已經(jīng)證明白菜型油菜的多室性狀受1對隱性核基因控制。在前期研究中，我們首次成功圖位克隆了白菜型黃籽沙遜ml4中的多室基因；發(fā)現(xiàn)Brclv3基因第3個外顯子中的1個單核苷酸突變(C/T)導致其CLEmotif中第9位的脯氨酸的突變，從而導致其產(chǎn)生多室表型。在本研究中，遺傳分析發(fā)現(xiàn)，srb中的多室性狀同樣受1對隱性核基因控制，這與前人的結(jié)果一致；進一步的等位測驗發(fā)現(xiàn)，srb中的多室基因與ml4中的相同(表2)。比較測序分析發(fā)現(xiàn)，srb的CLEmotif中存在一種新的單核苷酸突變(C/G)，可導致該保守結(jié)構(gòu)域的第12位組氨酸突變?yōu)?u>天冬氨酸(圖2)。進一步通過擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化試驗和體外多肽處理試驗證實，該單核苷酸突變可以引起B(yǎng)rCLV3基因功能的部分喪失，并引起多室角果的產(chǎn)生(圖4～圖6)。
 

大量研究表明，擬南芥CLV3基因編碼的蛋白經(jīng)過對CLEmotif的剪切和修飾，最終形成包含12～13個氨基酸的多肽信號來行使其所有功能。已有的研究表明，CLEmotif中每一位氨基酸對CLV3多肽功能的重要性有所不同。為了評估它們的貢獻大小，Kondo等通過氨基酸替換和體外多肽處理相結(jié)合的方法進行研究發(fā)現(xiàn)，R1、P9、H11和H12依次是影響CLV3功能最重要的4個氨基酸，而T2、S5、P7和L10等4個氨基酸的重要性最低。通過體外CLV3多肽信號與其受體進行競爭性結(jié)合的試驗表明，R1、H12、G6、P4和V3等5個氨基酸是影響CLV3信號與CLV1胞外受體結(jié)合最重要的氨基酸。為了在植物體內(nèi)更為準確地評價每個氨基酸的作用大小，Song等對CLV3多肽進行丙氨酸的替換和擬南芥clv3-2突變體互補轉(zhuǎn)化試驗發(fā)現(xiàn)，在CLV3調(diào)控SAM穩(wěn)態(tài)過程中，D8、H11、G6、P4、R1和P9等6位氨基酸的作用最為重要，其次為H12和L10，而T2、V3、S5和P7等氨基酸的作用并不重要。在這些研究中，P9對CLV3多肽都表現(xiàn)出重要的貢獻。因此，當白菜型油菜BrCLV3基因中的第9位脯氨酸發(fā)生自然突變時，會導致該基因功能的喪失，并引起多室角果的產(chǎn)生。H12對CLV3多肽的功能也十分重要，但重要性相對P9較弱。因此，不難理解在本研究中新發(fā)現(xiàn)的Brclv3Asp12等位突變僅能引起CLV3多肽活性的部分喪失(圖4～圖6)。由于H12是參與CLV3多肽信號與其受體結(jié)合的重要氨基酸，我們推測srb中BrCLV3基因脯氨酸到天冬氨酸的突變可能主要通過減弱CLV3多肽信號與受體結(jié)合的能力而降低了其活性。該結(jié)論還需要進一步的研究證據(jù)去證實。

4 結(jié)論

來自我國西藏的白菜型油菜srb具有穩(wěn)定的多室角果表型，該性狀受1對隱性核基因控制，且與黃籽沙遜ml4中的多室基因等位。比較測序分析發(fā)現(xiàn)，srb中BrCLV3基因的CLEmotif中存在一種新的單核苷酸突變，可導致該保守結(jié)構(gòu)域的第12位組氨酸突變?yōu)樘於彼?。針對該SNP開發(fā)的Brclv3Asp12等位基因特異標記在分離群體中與多室表型共分離表明，該SNP變異可能是引起srb油菜產(chǎn)生多室角果的原因。通過轉(zhuǎn)基因互補測驗和體外多肽的處理試驗都證明，Brclv3Asp12等位突變可以導致CLV3多肽活性的減弱。因此，本研究推測H12是參與白菜型油菜中CLV3多肽信號與其受體結(jié)合的重要氨基酸。

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