油菜是我國(guó)重要的油料作物,其角果一般由兩心皮的雌蕊發(fā)育而來(lái),角果內(nèi)被假隔膜分為兩室,種子著生于其中,外被兩片殼狀果瓣。在自然界中也發(fā)現(xiàn)了多室油菜突變體,其角果由多心皮雌蕊發(fā)育而成,角果內(nèi)被假隔膜分為3～5室,外被3～5片殼狀果瓣。這種自發(fā)突變體資源十分稀少,其中白菜型油菜(Brassicarapa,AA,2n=20)中主要有印度的黃籽沙遜多室油菜和中國(guó)西藏的桑日白油菜等2種多室材料；在芥菜型油菜(B.juncea,AABB,2n=36)中有山西的三筒油菜、貴州的四輪油菜、青海的多室油菜和四川的四棱油菜等多室油菜。已有研究表明,多室油菜相對(duì)于兩室油菜主要具有兩大優(yōu)良特性:(1)多室油菜具有較多的每角果粒數(shù),可顯著提高單株產(chǎn)量,在油菜的高產(chǎn)育種中具有應(yīng)用潛力；(2)多室角果的抗裂角性較強(qiáng),可用于抗裂角的研究和育種。因此,多室油菜作為一種新的種質(zhì)資源,闡明其形成的遺傳和分子機(jī)理,不僅可以豐富油菜花器官形態(tài)建成的理論,也有助于油菜高產(chǎn)新品種的培育。

遺傳研究表明,白菜型油菜中的多室/兩室相對(duì)性狀受1對(duì)主效核基因的控制,兩室性狀對(duì)多室性狀表現(xiàn)為完全顯性,且無(wú)細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的影響。通過(guò)圖位克隆的方法,Fan等發(fā)現(xiàn),擬南芥CLV3(CLAVATA3)的同源基因調(diào)控黃籽沙遜ml4多室角果的形成；轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)和體外多肽的處理試驗(yàn)證明,該基因的1個(gè)單核苷酸突變(C/T)導(dǎo)致其CLEmotif中第9位的脯氨酸突變成亮氨酸,引起CLV3多肽活性的喪失,最終導(dǎo)致了油菜多室角果的產(chǎn)生。在芥菜型油菜中,多室性狀受1個(gè)隱性核基因或2個(gè)獨(dú)立遺傳的隱性核基因控制,同樣兩室對(duì)多室表現(xiàn)為完全顯性,且無(wú)細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的影響。通過(guò)基因的精細(xì)定位,Xiao等和Xu等分別將擬南芥CLV3多肽信號(hào)的受體CLV1(CLAVATA1)的同源基因作為芥菜型油菜A7染色體上的多室候選基因。Xiao等進(jìn)一步證實(shí),BjuA07.CLV1基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子上的序列變異導(dǎo)致了芥菜型油菜多室的產(chǎn)生。在模式植物擬南芥中,CLV信號(hào)途徑調(diào)控了莖頂端分生組織內(nèi)干細(xì)胞的分裂與分化之間動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)CLV3多肽信號(hào)或其受體發(fā)生突變時(shí),CLV信號(hào)的傳遞就會(huì)受到影響,從而導(dǎo)致頂端分生組織的干細(xì)胞數(shù)目增加、多心皮雌蕊和多室角果的產(chǎn)生。鑒于CLV信號(hào)途徑在植物多室性狀形成中的重要作用,Yang等利用基因編輯技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜中的CLV3、CLV1和CLV2等同源基因進(jìn)行了突變,創(chuàng)建了具有穩(wěn)定多室性狀的突變體資源。由此表明,CLV信號(hào)途徑在不同類型油菜的多室角果形成過(guò)程中具有功能保守性。

來(lái)自西藏的桑日白油菜(簡(jiǎn)稱srb)是目前在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的僅有的白菜型多室突變材料,與黃籽沙遜多室油菜具有完全不同的來(lái)源；該突變體的多室性狀表現(xiàn)穩(wěn)定,且受1對(duì)隱性基因控制。但至今仍然沒(méi)有該材料中的多室基因精細(xì)定位和克隆的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本研究對(duì)srb突變體的遺傳進(jìn)行了分析,并通過(guò)與ml4突變體的等位測(cè)驗(yàn)以及候選基因的驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)了該材料中存在的一種新的BrCLV3基因等位突變導(dǎo)致了多室角果的產(chǎn)生。該研究為進(jìn)一步深入解析BrCLV3基因參與油菜多室性狀形成的分子機(jī)制提供了重要的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其種植

所用的白菜型油菜包括兩室黃籽沙遜(野生型,簡(jiǎn)稱WT)、多室黃籽沙遜ml4以及來(lái)自西藏的多室srb。將srb分別與WT和ml4進(jìn)行正反交得到F₁,然后自交產(chǎn)生F₂分離群體,用于srb多室性狀的遺傳分析。所有材料于2017年9月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜玻璃溫室進(jìn)行盆栽種植,花盆直徑25cm,每盆定苗4株,參照正常方法管理溫室,翌年1月至2月份調(diào)查花器官數(shù)目和角果心皮數(shù)目變異。擬南芥突變體clv3-2和野生型Landsbergerecta(ler)購(gòu)自美國(guó)ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。在晝/夜16h/8h、22℃/18℃、光照強(qiáng)度115～144μmolm^-2s^-1的培養(yǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)。

1.2 BrCLV3等位基因的比較測(cè)序

在白菜型油菜中僅存在1個(gè)CLV3的同源拷貝,即位于A4染色體上的BrCLV3(Bra034340)。針對(duì)該基因的不同區(qū)域共設(shè)計(jì)了3對(duì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增,其中DXP118/DXP120擴(kuò)增2260bp的啟動(dòng)子區(qū)域,DXP117/DXP121擴(kuò)增基因編碼區(qū),DXP125/DXP136擴(kuò)增2541bp的3'下游區(qū)。具體引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物連入pMD18-T載體上,每個(gè)擴(kuò)增片段挑選4～5個(gè)陽(yáng)性克隆采用載體通用引物測(cè)序；使用Sequencher3.1.2軟件比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

1.3 SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與基因型分析

利用SNAPER程序,針對(duì)Brclv3Asp12中的C/G單核苷酸變異開(kāi)發(fā)特異性的SNP標(biāo)記,其中引物對(duì)DXP246/249和DXP248/DXP249分別特異性擴(kuò)增Brclv3Asp12和BrCLV3等位基因。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。SNP標(biāo)記的PCR擴(kuò)增體系含50ngµL-1的模板DNA2.0µL、10×PCRbuffer1.0µL、2mmolL^-1dNTPs0.8µL、10µmolL^-1引物各0.15µL、2UµL^-1TaqDNA聚合酶0.15µL,添加ddH2O至10μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.4 Brclv3Asp12的超量表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)分別帶有PacI和AscI酶切接頭的引物對(duì)DXP113/DXP114,從srb突變體的cDNA中克隆Brclv3_Asp12等位基因,通過(guò)酶切連接方法連入pMDC83質(zhì)粒載體的35S啟動(dòng)子后面,獲得35S::Brclv3_ASP12超量表達(dá)載體。引物序列見(jiàn)表1。載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101后通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變體。收獲的種子播種到含有潮霉素抗性的0.5×MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

1.5 石蠟切片的制作與顯微觀察

選取花蕾進(jìn)行石蠟切片的制作,具體操作程序見(jiàn)Fan等的方法。采用Nikoneclipse80i顯微鏡(日本)觀察切片并照相。

1.6 多肽的合成與體外處理

分別合成野生型多肽BrCLV3(RTVPSGPDPLHH)和突變型多肽Brclv3ASP12(RTVPSGPDPLHD),純度＞95%(金斯瑞,中國(guó)南京)。用超純水溶解成1mmolL^-1母液后過(guò)濾消毒,保存于−20℃冰箱中備用。將表面消毒的擬南芥種子在添加多肽的液體和固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),分別觀察多肽對(duì)莖頂端分生組織(shootapicalmeristem,SAM)和主根生長(zhǎng)的影響。具體操作程序見(jiàn)Fan等的方法。每種處理至少設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

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