1.2.4 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

檢測樣品，量取1 mL的10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于盛有10 mL衍生液的50 mL具塞離心管中，設(shè)置衍生環(huán)境pH分別為2,3,4,5,6,衍生溫度為60 ℃,衍生時(shí)間為60 min, 考察不同pH對甲醛以及樣品衍生的影響。

檢測樣品，量取1 mL的10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于盛有10 mL衍生液的50 mL具塞離心管中，設(shè)置衍生環(huán)境溫度分別為25,40,60,80 ℃,衍生pH為2～5,衍生時(shí)間為60 min, 考察不同溫度對甲醛以及樣品衍生的影響，以峰面積來表示。

1.2.5 試驗(yàn)方法的驗(yàn)證

回收率：精確稱量勻漿樣品10.00 g, 添加3個(gè)梯度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(10,15,20 μg/mL)1 mL至樣品中，靜置5 min, 依照本試驗(yàn)建立的檢測方法進(jìn)行回收率的驗(yàn)證，依照2.2.2的方法操作。

精密度：通過計(jì)算單日內(nèi)每隔2 h連續(xù)3次測量10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。

方法的線性范圍：按照上述操作條件及色譜條件，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測量3次，測量獲得的峰面積以平均值帶入線性范圍計(jì)算。

檢測限及定量限：通過連續(xù)稀釋試驗(yàn)獲得定量極限(LOQ),并根據(jù)10∶1的信噪比(S/N)進(jìn)行估算；檢出限(LOD)由3∶1的信噪比(S/N)估算，是可通過該方法檢測到或與空白基質(zhì)的背景噪聲區(qū)分開的最低分析物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

香菇醬作為香菇的加工制品，是一種大眾樂見餐桌上的調(diào)味醬，但是由于香菇作為香菇醬的主要原材料之一，其甲醛含量偏高,甲醛對皮膚和黏膜具有強(qiáng)烈的刺激作用。香菇在加工保藏過程中依舊含有甲醛殘留,如高溫導(dǎo)致的美拉德反應(yīng);加工過程會(huì)影響香菇自身代謝從而產(chǎn)生甲醛;包裝會(huì)有甲醛的遷移或污染等。

高效液相色譜法具有檢測限低等優(yōu)勢，基于此，開發(fā)出一種適合香菇醬特性的穩(wěn)定可靠的甲醛檢測方法。

1 材料與方法

.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、乙腈(色譜純)、2,4-二硝基苯肼(色譜純)、硫酸銨(分析純)、冰醋酸(分析純):麥克林試劑有限公司；醋酸鈉(分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(配紫外檢測器) Waters 公司；分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；THZ-82A超級(jí)恒溫水浴振蕩器 常州澳華儀器有限公司；3K15高速臺(tái)式離心機(jī) Sigma 離心機(jī)(揚(yáng)州)有限公司；pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將樣品充分勻漿，準(zhǔn)確稱取樣品10.00 g, 置于50 mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL衍生緩沖液，蓋緊蓋子，渦旋混勻后置于60 ℃,150 r/min水浴鍋中，振搖1 h, 然后冷卻至室溫。加入5 g硫酸銨，渦旋混勻，以8000 r/min離心10 min后，移取上清液于具塞試管中，下層溶液用10.0 mL乙腈重復(fù)萃取1次，離心，合并上清液，用乙腈定容至20.0 mL,混勻，過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC檢測。

1.2.2 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，加衍生緩沖液定容至20 mL,配制成0,0.5,1,1.5,2,2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，蓋緊蓋子，渦旋混勻后置于60 ℃,150 r/min水浴鍋中，振搖1 h, 然后冷卻至室溫，過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC檢測，以甲醛的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 色譜條件

參考色譜條件并加以改進(jìn)，色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫25 ℃;紫外檢測器；檢測波長352 nm; 流動(dòng)相：乙腈-水(70∶30,V/V),進(jìn)樣量10 μL;流速1 mL/min, 等度洗脫。

1.2.4 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

檢測樣品，量取1 mL的10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于盛有10 mL衍生液的50 mL具塞離心管中，設(shè)置衍生環(huán)境pH分別為2,3,4,5,6,衍生溫度為60 ℃,衍生時(shí)間為60 min, 考察不同pH對甲醛以及樣品衍生的影響。

檢測樣品，量取1 mL的10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于盛有10 mL衍生液的50 mL具塞離心管中，設(shè)置衍生環(huán)境溫度分別為25,40,60,80 ℃,衍生pH為2～5,衍生時(shí)間為60 min, 考察不同溫度對甲醛以及樣品衍生的影響，以峰面積來表示。

1.2.5 試驗(yàn)方法的驗(yàn)證

回收率：精確稱量勻漿樣品10.00 g, 添加3個(gè)梯度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(10,15,20 μg/mL)1 mL至樣品中，靜置5 min, 依照本試驗(yàn)建立的檢測方法進(jìn)行回收率的驗(yàn)證，依照2.2.2的方法操作。

精密度：通過計(jì)算單日內(nèi)每隔2 h連續(xù)3次測量10 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。

方法的線性范圍：按照上述操作條件及色譜條件，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測量3次，測量獲得的峰面積以平均值帶入線性范圍計(jì)算。

檢測限及定量限：通過連續(xù)稀釋試驗(yàn)獲得定量極限(LOQ),并根據(jù)10∶1的信噪比(S/N)進(jìn)行估算；檢出限(LOD)由3∶1的信噪比(S/N)估算，是可通過該方法檢測到或與空白基質(zhì)的背景噪聲區(qū)分開的最低分析物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 液相圖

由圖1可知，甲醛的保留時(shí)間為5 min。

2.1.2 衍生pH的優(yōu)化

由圖2可知，在酸性條件下，加強(qiáng)了正電性，有利于2,4-二硝基苯肼的進(jìn)攻，形成2,4-二硝基苯腙,所以當(dāng)pH為6時(shí)，衍生效果較差。由圖2中A可知，甲醛在pH為4時(shí)衍生效果最好，其中pH為2和3時(shí)，衍生效果一般，主要是由于過酸的條件下在色譜柱上吸附效果較差。由圖2中B可知，在不同pH的條件下溶出不同的物質(zhì)，但是這些物質(zhì)的變化主要集中在4 min以前，不影響對甲醛-2,4-二硝基苯腙的定量。因此，選擇pH 4～5作為反應(yīng)體系的最適pH,考慮到樣品為半固體，所以通過配制pH 3.6的醋酸鹽緩沖溶液，調(diào)節(jié)提取液環(huán)境，經(jīng)檢測pH為4.61。

2.1.3 衍生溫度

由圖3中A可知，隨著溫度的升高，峰面積逐漸增加，而80 ℃時(shí)的峰面積最大，其源于在溫度較高的情況下乙腈揮發(fā)提升待測溶液中2,4-二硝基苯肼的濃度導(dǎo)致峰面積增加。由圖3中B可知，隨著衍生溫度的升高，會(huì)產(chǎn)生新的醛類物質(zhì)，影響檢測；而1 h內(nèi)常溫衍生難以衍生完全，所以選擇40～60 ℃作為反應(yīng)體系的最適衍生溫度。

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