1963年，俞?；莸劝l(fā)現(xiàn)二氫查爾酮及其衍生物可作為甜味劑，并從柑橘黃烷酮中提取了柚皮苷二氫查爾酮（NariNgiNDC）等。二氫查爾酮的甜味持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，口感清爽，甜度高，熱量低，安全無毒，能有效的屏蔽苦味。二氫查爾酮類化合物對(duì)糖尿病有一定作用。此外，二氫查爾酮類化合物具有藥效基團(tuán)-2，6-二羥基苯乙酮結(jié)構(gòu)，該基團(tuán)有抗氧化作用，通過消除過氧化物、清除羥自由基來實(shí)現(xiàn)。歐陽振宇以柚皮渣為原料，超聲波輔助提取柚皮苷，并用D101大孔樹脂分離富集，得到純度為83.7%的柚皮苷；對(duì)柚皮苷在堿性條件下加壓并以鈀碳作為催化劑合成柚皮苷二氫查爾酮（NariNgiNDC），產(chǎn)率為85.2%。文獻(xiàn)和以超聲波輔助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷，并用弱極性AB-8樹脂分離純化柚皮苷，NaOH作為洗脫劑，得到純度為77.26%的柚皮苷堿溶液，最后將該堿液在催化劑雷尼鎳的作用下，加氫合成NariNgiNDC。李晚誼等研究表明云南甜茶有強(qiáng)的過敏作用，其抗過敏作用的有效成分是二氫查爾酮-4’-β-D葡萄糖苷和二氫查爾酮-2’-β-D葡萄糖苷。方旭兵等研究表明龍血樹醇提取物龍血竭的主要成分——龍血素A和龍血素B均為二氫查爾酮類化合物，經(jīng)對(duì)相關(guān)二氫查爾酮合成和修飾以及用HepG2細(xì)胞進(jìn)行抗肝癌腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)二氫查爾酮類化合物中F-18和F-16抗肝癌腫瘤活性較好。楊美琪研究表明利用硅膠、大孔樹脂、MCi-CHP20P及葡聚糖凝膠柱等分離方法，結(jié)合薄層色譜及HPLC分析木棗棗根醇提物，得到含量較高的二氫查爾酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖苷等16個(gè)化合物。目前，NariNgiNDC的活性研究報(bào)道較少，本研究對(duì)其抗氧化活性和美白活性進(jìn)行初步探討。

1材料與方法

1.1材料、試劑與設(shè)備

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉；NariNgiNDC標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉；新橙皮苷二氫查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉；ABTs，碧云天生物；酪氨酸酶，上海源葉；其它試劑均為分析純；AuToｄoCkviNa1.1.2，美國(guó)sCripps研究所。EL204-iC分析天平，美國(guó)METTLERTOLEDO公司；5ML移液槍，美國(guó)EppeNｄorF公司；syNergyTX多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；MuLTiskaNGo全波長(zhǎng)讀數(shù)儀，美國(guó)TherMosCieNTiFiC公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1ABTs自由基清除能力測(cè)定

通過3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.30Mg/MLNHDC、0.0025Mg/ML槲皮素與ABTs自由基反應(yīng)，測(cè)定其吸光值，繪制TroLox（0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50MMoL/L）標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其與TroLox的相同清除能力時(shí)的用量。具體操作步驟：

1）在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200μLABTs工作液。

2）空白對(duì)照孔中加入10μL蒸餾水或PBs等適當(dāng)溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10μL各種濃度的TroLox標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10μL樣品，輕輕混勻。

3）室溫孵育2～6MiN，于波長(zhǎng)734NM處測(cè)定吸光度。

4）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力，用TroLox等效抗氧化能力（TroLoxEquivaLeNTANTioxiｄaNCapaCiLy，TEAC）來表示。

1.2.2羥自由基清除能力測(cè)定

通過3.0Mg/ML柚皮苷、1.0Mg/MLNariNgiNDC、0.50Mg/MLNHDC、0.15Mg/ML槲皮素與羥自由基反應(yīng)，測(cè)定其吸光值，繪制TroLox（0.01，0.025，0.05，0.10，0.15Mg/L）標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其與TroLox的當(dāng)量，進(jìn)而比較抗氧化能力強(qiáng)、弱。

按照表1所列順序向酶標(biāo)板中加入對(duì)應(yīng)試劑，按表1規(guī)定的條件操作，以TroLox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的抗氧化能力根據(jù)式（1）進(jìn)行計(jì)算?？寡趸芰χ狄訲roLox相同抗氧化能力時(shí)的用量（μMoLTroLox物質(zhì)的量/g）表示，即1g樣品相當(dāng)于TroLox的μMoL數(shù)。

式中，A_樣品—樣品吸光度；A_空白—樣品空白吸光度；A_TroLox—TroLox溶液吸光度；M_TroLox—TroLox溶液的物質(zhì)的量（μMoL）；M_樣品—樣品的質(zhì)量（Mg）。

FerriC-TPTZ工作液[300MMoL/L醋酸鹽緩沖液（0.31g三水合醋酸鈉+1.6ML冰醋酸+超純水至100ML，pH3.6]、10MMoL/LTPTZ的40MMoL/鹽酸溶液和20MMoL/LFeCL₃·6H₂O溶液，以體積比10∶1∶1混合），室溫反應(yīng)30MiN后，于波長(zhǎng)593NM處用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。吸光值的大小與樣品的抗氧化能力成正比。維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度為：25，50，100，200，400，800μMoL/L，測(cè)定結(jié)果以維生素C為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μMoLAAE/g干重。平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值計(jì)算。

1.2.4 ORAC法測(cè)定樣品的氧自由基清除能力

通過3.00g/L柚皮苷、1.00g/LNariNgiNDC、3.00g/LNHDC、0.0125Mg/ML槲皮素與過氧自由基反應(yīng)，測(cè)定其吸光值，繪制TroLox（62.5，125，250，500，500，1000MoL/L）標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其與TroLox的物質(zhì)的量，比較抗氧化能力強(qiáng)、弱。

該方法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，熒光素鈉鹽為熒光指示劑。將熒光素鈉鹽、AAPH和水溶性維生素C類似物TroLox分別用磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶解，在96孔板中依次加入25μL各濃度的TroLox標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品以及200μL熒光光素鈉鹽溶液（8.68NMoL/L），然后，將孔板放入熒光酶標(biāo)儀中，用GeNe5軟件編程操作，37℃預(yù)熱30MiN，迅速加入AAPH溶液25μL（153MMoL/L），自動(dòng)振蕩搖勻，在激發(fā)波長(zhǎng)485NM，發(fā)射波長(zhǎng)528NM處用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定。初始吸光強(qiáng)度值記為f₀，以后每隔1MiN測(cè)定一個(gè)點(diǎn)，共測(cè)定120MiN，熒光強(qiáng)度分別記為f₀，f₁，f₂…f₁₂₀，根據(jù)公式（2）統(tǒng)計(jì)各濃度的曲線下面積AUC值。ORAC的含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)。

TroLox標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度分別為62.5，125，250，500，1000μMoL/L，測(cè)定結(jié)果以TroLox為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μMoLTroLox（TE）/g干重。平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值計(jì)算。

1.2.5 NariNgiNDC與人銅鋅超氧化物歧化酶sOD的分子對(duì)接

采用CheMBioDrawULTra14.0畫出化合物槲皮素和NariNgiNDC的結(jié)構(gòu)，然后用CheMBio3DULTra14.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并用sybyL軟件的MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化。人銅鋅超氧化物歧化酶sOD的三維結(jié)構(gòu)（PDBiD：3RE0）從RCsB蛋白數(shù)據(jù)庫下載。銅鋅超氧化物歧化酶和化合物均使用AuToｄoCkTooLs1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。采用AuToｄoCkviNa1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接。銅鋅超氧化物歧化酶活性位點(diǎn)的坐標(biāo)設(shè)置為：size_x=15，size_y=15，size_z=15；CeNTer_x=1.346，CeNTer_y=-3.077，CeNTer_z=30.419。為了增加計(jì)算的準(zhǔn)確度，將參數(shù)exhausTiveNess設(shè)置為20。除了特別說明，其它參數(shù)均采用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用PyMoL1.7.6進(jìn)行結(jié)果分析。1.2.6酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)通過熊果苷（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、柚皮苷（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、NariNgiNDC（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）、NHDC（0.625，1.25，2.5，5，10Mg/ML）與酪氨酸酶反應(yīng)測(cè)定其吸光值并繪制曲線，求出iC50值，進(jìn)而比較抗氧化能力強(qiáng)、弱。

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