以多巴（L-DOPA）為底物，測(cè)定酪氨酸酶的活性。先將待測(cè)樣品用無水乙醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1Mg/ML的貯備液，再依次稀釋成不同濃度的樣品溶液。按表2所示，依次準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液，pH6.8的0.5MoL/L磷酸鹽緩沖溶液，0.5MMoL/LL-DOPA溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶溶液，充分混勻，在37℃水浴鍋中孵育反應(yīng)30MiN，然后立即測(cè)定各試管中反應(yīng)溶液在475NM處的吸光值。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。根據(jù)酶反應(yīng)活性的定義，在一定的抑制劑濃度下，酶反應(yīng)活性表示為ACTi，在沒有抑制劑時(shí)酶反應(yīng)活性表示為ACT0，則受試樣品對(duì)酶的相對(duì)抑制率（I）可以定義為：
 

式中，ACTi—有抑制劑時(shí)的酶反應(yīng)活性；ACT₀—沒有抑制劑時(shí)的酶反應(yīng)活性；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，4號(hào)反應(yīng)液的吸光值。

1.2.7 B16黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞MTT試驗(yàn)

稱取50g重鉻酸鉀固體，以100ML蒸餾水100℃溶解（電爐加熱），快速加入900ML濃H₂sO₄，混勻，冷卻即可使用。MTT用PBs配制成質(zhì)量濃度5Mg/ML，過0.22μM水相濾膜后存于10ML無菌離心管中，于-20℃冷凍保存。具體步驟：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷的標(biāo)準(zhǔn)品

20Mg，加入DMsO溶解配成500MMoL/L的母液，過0.22μM有機(jī)濾膜后以每管20μL分裝于無菌的200μL離心管中，于-20℃冷凍保藏。

2）不同濃度樣品的配制

分別取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷3種物質(zhì)500MMoL/L的母液各4μL，加入4ML1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配成500μMoL/L的溶液，然后分別稀釋到250，125，62.5μMoL/L3個(gè)濃度。

3）96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞

在超凈工作臺(tái)中移取5ML75T細(xì)胞培養(yǎng)瓶終止消化后的細(xì)胞與培養(yǎng)液的混合液于離心管中，800r/MiN離心4MiN，棄上清液，移取3ML完全培養(yǎng)基于離心管并混勻細(xì)胞液，取上述1ML細(xì)胞液，加1ML完全培養(yǎng)基，取80μL于平板計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細(xì)胞濃度為8000個(gè)細(xì)胞/100μL，用12通道移液槍將細(xì)胞液混勻，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μL，做好標(biāo)記后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

4）96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入樣品

將上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，用廢液真空泵吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的樣品150μL，并且每塊96孔板都要留1到2列只加基礎(chǔ)培養(yǎng)基做空白對(duì)照，做好標(biāo)記后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

5）B16黑色素瘤細(xì)胞的MTT試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)中，取PBs配成質(zhì)量濃度5Mg/ML的MTT溶液，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以體積比1∶9的比例配成MTT細(xì)胞培養(yǎng)液。將步驟4）中加樣品培養(yǎng)24h后的細(xì)胞培養(yǎng)液用廢液真空泵吸棄，每孔加入150μLMTT細(xì)胞培養(yǎng)液，做好標(biāo)記后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，吸棄MTT細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMsO，于酶標(biāo)儀中振動(dòng)10MiN后測(cè)定波長(zhǎng)490NM處的吸光度值。

細(xì)胞存活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不加樣品的空白吸光度值；Ax—加不同濃度樣品作用后的吸光度值。

1．2.8 B16黑色素瘤細(xì)胞HoeChsT熒光染色試驗(yàn)

具體操作步驟：

1）于超凈工作臺(tái)上，打開六孔板，置滅菌蓋玻片。將細(xì)胞懸液滴加至蓋玻片上，置CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞固著（約2h），加入2ML細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6h。棄培養(yǎng)基，用PBs洗3次，每次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定30MiN，PBs洗3次，每次5MiN。

3）切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加適量HoeChsT染液到爬片上，室溫避光孵育15MiN。

4）PBs漂洗爬片3次，每次5MiN，從六孔板內(nèi)取出爬片，將有細(xì)胞的一面封到滴加有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9 NariNgiNDC與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對(duì)接

采用CheMBioDrawULTra14.0畫出化合物熊果苷和NariNgiNDC的結(jié)構(gòu)，然后用CheMBio3DULTra14.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化。雙孢蘑菇酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)（PDBiD：2Y9X）從RCsB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載。酪氨酸酶和化合物均使用AuToｄoCkTooLs1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。采用AuToｄoCkviNa1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接。酪氨酸酶活性位點(diǎn)的坐標(biāo)設(shè)置為：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了增加計(jì)算的準(zhǔn)確度，將參數(shù)exhausTiveNess設(shè)置為20。其它參數(shù)均用默認(rèn)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用PyMoL1.7.6進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素對(duì)ABTS自由基的清除效果

以TroLox作為對(duì)照，以其濃度-吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3627x+0.0661（R2=0.9943），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4種樣品對(duì)ABTs自由基清除效果，結(jié)果見圖3。4種樣品對(duì)ABTs自由基清除效果以TroLox的抗氧化物質(zhì)的量表示，結(jié)果見表3。

由表3可知，4種樣品對(duì)ABTs自由基均有清除作用。以TroLox作為對(duì)照，4種樣品的總抗氧化能力結(jié)果中，柚皮苷的TroLox抗氧化物質(zhì)的量為0.1748MMoL/g，NHDC為2.9109MMoL/g，NariNgiNDC為0.6986MMoL/g，槲皮素為39.6103MMoL/g。4種樣品對(duì)ABTs自由基清除能力依次為槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素對(duì)羥自由基的清除效果

以TroLox為對(duì)照，以其濃度-吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.0588x+0.079（R2=0.9998），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4種樣品對(duì)羥自由基清除效果，結(jié)果見圖4。4種樣品對(duì)羥自由基清除效果以TroLox的抗氧化物質(zhì)的量表示，結(jié)果見表4。

由表4可看出，4種樣品對(duì)羥自由基均有清除作用，試驗(yàn)中以TroLox作為對(duì)照，得到柚皮苷清除能力的TroLox物質(zhì)的量為19.8μMoL/g，NariNgiNDC為31.9μMoL/g，NHDC為44.4μMoL/g，槲皮素為365.5μMoL/g。4種樣品清除羥自由基能力依次為槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

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