乳酸菌飲料是指以乳或乳制品為原料，經(jīng)化料、水合、殺菌，接種發(fā)酵劑所得發(fā)酵基料，按照一定比例混入水、食品添加劑（甜味劑、酸味劑、穩(wěn)定劑）調(diào)配后制得的飲料。乳酸菌飲料作為健康飲品以其獨(dú)特的風(fēng)味和優(yōu)質(zhì)的保健功效贏得廣大消費(fèi)者的追捧。相關(guān)資料顯示，近5年，世界乳酸菌飲料市場(chǎng)份額不斷增加，其市場(chǎng)規(guī)模超過500億美元。益生菌是一類能夠改善宿主腸道菌群平衡并有效增強(qiáng)食用者身體健康水平的活性有益微生物，其具有改善便秘、緩解腹瀉、抗腫瘤、保護(hù)口腔健康等重要生理功效；Buriti等應(yīng)用L.rhamnosusLR-32和B.lactisBB12復(fù)配發(fā)酵山羊乳清飲料，并添加適量的膳食纖維，所得產(chǎn)品在貯藏期（4℃、24d）內(nèi)活菌數(shù)維持在1×108CFU/g以上，膳食纖維的添加能夠改善山羊乳清飲料的口感、風(fēng)味并增進(jìn)其功能特性，活性乳酸菌飲料將菌株的益生特性與乳制品的健康功效完美結(jié)合，同時(shí)乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種維生素、有機(jī)酸、抗菌肽等生物活性物質(zhì)能夠有效提高產(chǎn)品的功能特性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者主要針對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵劑在發(fā)酵乳中的產(chǎn)香機(jī)理進(jìn)行研究，而對(duì)于復(fù)合益生菌在發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性代謝物及產(chǎn)香機(jī)制研究較少。Karacali等研究開菲爾粒對(duì)雙蛋白乳飲料（按牛奶與豆奶質(zhì)量比17:3混合）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用開菲爾粒發(fā)酵能夠促進(jìn)雙蛋白飲料中雙乙酰、乙偶姻等具有脂肪香、奶油氣息等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，降低其（E）-2-己烯醛、1-己醇等致豆腥味揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GCMS）具有操作簡單、靈敏度高、分析范圍廣等特點(diǎn)，目前，該技術(shù)主要用于乳制品、肉制品以及發(fā)酵果蔬中風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)。

本研究以含有8株菌株的復(fù)合益生菌發(fā)酵3種基料的乳酸菌飲料為對(duì)象，應(yīng)用SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析乳酸菌飲料發(fā)酵及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性代謝物的變化，通過OAＶ值確定乳酸菌飲料中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)3種基料的乳酸菌飲料整體風(fēng)味進(jìn)行比較預(yù)測(cè)，為復(fù)合益生菌的商業(yè)化應(yīng)用及活性乳酸菌飲料的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)菌株本試驗(yàn)所用益生菌（見表1）直投式發(fā)酵劑由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2儀器與試劑

SRH60-70高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890BGCsystem-5977AMSD），賽默飛世爾科技有限公司；色譜柱（HP-5毛細(xì)管柱30m×0.25mm，0.25μm），賽默飛世爾科技有限公司；手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣手柄（USA，SUP-ELCO），賽默飛世爾科技有限公司；固定搭載裝置及50/30μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，賽默飛世爾科技有限公司；陶瓷加熱磁力攪拌器（Corning），美國Agilent公司；脫脂乳粉（蛋白質(zhì)含量33%），新西蘭NZMP；濃縮乳清蛋白粉（蛋白質(zhì)含量80%），美國HILMAR公司；大豆分離蛋白粉（蛋白質(zhì)含量95%，富吉普樂200），吉林不二蛋白有限公司；C3-C9正構(gòu)烷烴混標(biāo)（AccuStandard，USA）、C10-C25正構(gòu)烷烴混標(biāo)（AccuStandard，USA）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、1，2-二氯苯（色譜純）等均購于美國Sigma公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌飲料的制備

分別將脫脂乳粉（12.1%）、乳清蛋白粉（5.0%）、大豆分離蛋白粉（4.2%）與葡萄糖（2%）混合溶解于預(yù)熱至55℃的蒸餾水中，水合30min，85℃殺菌15min，冷卻至37℃，將復(fù)合菌株按照總接種量5×106CFU/g接入3種不同發(fā)酵基料中，具體接種量如表2所示，3種發(fā)酵基料蛋白質(zhì)含量均為4%，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，待到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)得發(fā)酵基料（復(fù)合益生菌在3種基料中生長至穩(wěn)定期）；將發(fā)酵基料與預(yù)先溶解并冷卻的穩(wěn)定劑、甜味劑混合，調(diào)配，20MPa均質(zhì)，所得樣品（蛋白質(zhì)含量均為1%）即為發(fā)酵基料不同的3種乳酸菌飲料。

1.2.2發(fā)酵前及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

采用50/30μmDＶB/CAR/PDMS萃取頭，對(duì)發(fā)酵前及發(fā)酵結(jié)束后貯藏0，14，28d的脫脂乳飲料、豆乳飲料、乳清飲料進(jìn)行富集，每組3個(gè)平行，隨后應(yīng)用GC-MS技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.3揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件與測(cè)定條件

1）色譜條件載氣為He，流速1.0mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃。程序升溫方式，起始溫度為35℃，保持5min后以5℃/min的速率上升至140℃，保持2min，再以10℃/min的速率上升至250℃，保持3min。

2）質(zhì)譜條件全掃描模式；EI離子源；電子能量70eＶ；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500；無溶劑延遲。

3）SPME萃取條件50℃平衡60min。

4）解吸附條件250℃條件下解吸附3min。

1.2.4定性、定量分析

定性方法：利用隨機(jī)攜帶Masshunter工作站NISＴ11標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，挑選匹配率≥85%的物質(zhì)作為鑒定結(jié)果，同時(shí)依據(jù)Ｖandendool等的方法測(cè)定保留指數(shù)（retentionindices，RI），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的RI值對(duì)發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行再次鑒定，RI值計(jì)算公式如下：

式中：RＴ_（z）、RＴ_（z+1）和RＴ_（x）分別為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)為Z、Z+1和待測(cè)物x的保留時(shí)間，且RＴ_（z）＜RＴ_（x）＜RＴ_（z+1）。

定量方法：在5mL發(fā)酵樣品中添加質(zhì)量濃度為0.01μg/L的內(nèi)標(biāo)物1，2-二氯苯溶液50μL，樣品中各組分風(fēng)味物質(zhì)的濃度可代入公式（2）計(jì)算：

式中：C_i—待測(cè)樣品中各風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度，μg/L；Cs—1，2-二氯苯質(zhì)量濃度，μg/L；A_i—樣品中待測(cè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積；As—內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積。

1.2.5香氣活度值評(píng)價(jià)法

在對(duì)乳酸菌飲料中揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量的基礎(chǔ)上，以各風(fēng)味化合物在水中的風(fēng)味閾值作為參考，計(jì)算能表征風(fēng)味化合物貢獻(xiàn)率的物理量—香氣活度值（odoractivityvalue，OAＶ）?？纱牍剑?）計(jì)算：

式中：OAV_i—風(fēng)味化合物i的香氣活度值；

C_i—乳酸菌飲料中揮發(fā)性風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度，μg/L；OT_i—所測(cè)風(fēng)味化合物在水中的氣味閾值。

1.3數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行顯著性、主成分分析處理，使用Originlab2017、SIMCA-P14.1作圖。

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相關(guān)鏈接：乳酸菌，2-二氯苯，聚二甲基硅氧烷，丙酮