Copines蛋白家族是一類Ca2+依賴磷脂結(jié)合蛋白，分布廣泛且進(jìn)化保守。該家族成員在結(jié)構(gòu)上具有相同特征:N末端有兩個與已知的Ca2+依賴磷脂結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域高度相似的C2結(jié)構(gòu)域;C末端有1個與整合蛋白(integrin)胞外區(qū)的A結(jié)構(gòu)域具有同源性的A結(jié)構(gòu)域。目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)8個該蛋白家族成員，分別為Copine-1～Copine-8(基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白是最先被發(fā)現(xiàn)的。Yoo等通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1蛋白表達(dá)能夠抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以上調(diào)內(nèi)源性Copine-1蛋白的表達(dá)，且TNF-α信號傳導(dǎo)途徑對毒蕈堿刺激的反應(yīng)隨著Copine-1表達(dá)的增加而增強(qiáng);Copine-1蛋白還可以增強(qiáng)核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依賴性降解。此外，Copine-1蛋白與p65相互作用能夠消除核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的轉(zhuǎn)錄。Copine-6蛋白主要在神經(jīng)元中表達(dá)，研究表明，Copine-6蛋白在癲癇腦組織中的異常表達(dá)可能與難治性癲癇有重要聯(lián)系。Copine-7蛋白是一種成神經(jīng)細(xì)胞衍生因子，能夠調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和正向調(diào)控牙本質(zhì)唾液磷蛋白表達(dá)。Copine-8蛋白可能是一個抑制急性髓性白血病癌細(xì)胞增殖的因子。

Copine-3蛋白與Copine-1蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)63%，其在人體的腦、肺、心臟、腎臟組織中均有表達(dá)。Caudell等發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性Copine-3蛋白和外源表達(dá)的重組Copine-3蛋白均可使外源髓鞘磷脂堿性蛋白磷酸化，然而，Copine-3蛋白氨基酸序列中缺少已知的激酶催化結(jié)構(gòu)域，這些研究提示，Copine-3蛋白可能具有內(nèi)在的激酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，Copine-3蛋白的高表達(dá)與急性骨髓性白血病的不良預(yù)后有關(guān)。Tan等研究發(fā)現(xiàn)，與患有慢性冠狀動脈疾病的患者相比，急性心肌梗死患者的外周血中Copine-3蛋白的表達(dá)量更低，表明CPNE3基因的低表達(dá)是發(fā)生急性心肌梗死的潛在危險因素。綜上所述，Copine-3蛋白在人體組織中廣泛表達(dá)，但其在細(xì)胞中的功能尚不明確。

本研究利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞293T、肺腺癌細(xì)胞H1299，瞬時表達(dá)Copine-3-EGFP融合蛋白，觀察并檢測Copine-3蛋白在細(xì)胞中的定位，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1．主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培養(yǎng)基購自Gibco公司;107IU/L青霉素+10 g/L鏈霉素(雙抗)、0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液購自索萊寶科技有限公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent轉(zhuǎn)染試劑、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片劑、Copine-3抗體(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)購自Invitrogen公司;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶以及High Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit購自Ta KaRa公司;總RNA提取、質(zhì)粒提取、DNA純化試劑盒以及T4連接酶購自天根生化科技(北京)有限公司;GAPDH抗體(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗體(兔抗人Ig G,1 g/L)購自Affinity公司;Histone H1抗體(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa公司);HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)購自Bioworld公司;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA測序由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司完成;GTVisionⅢ型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自基因科技(上海)股份有限公司，肺腺癌組織芯片(HLug A030PG03)購自上海芯超生物科技有限公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);小型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);蛋白電泳儀(Bio-Rad公司);Western轉(zhuǎn)印儀(Hoefer公司);熒光倒置顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡(Leica公司)。

2. 實驗方法

2.1 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:

人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,HBE)接種于6孔板中，用含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)至90%匯合。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，500 r/min離心5 min收集。按天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒(DP419)說明書操作進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。將提取到的細(xì)胞總RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書操作，反轉(zhuǎn)錄獲得c DNA。

2.2 人CPNE3基因的擴(kuò)增:

根據(jù)CPNE3基因編碼序列(片段全長1613 bp)，設(shè)計合成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和下游引物5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、下游引物分別加入XhoⅠ、Bam HⅠ酶切位點(下劃線為酶切位點序列)。以c DNA為模版，PCR擴(kuò)增CPNE3基因編碼序列，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸2 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，膠回收與目的片段大小相同的DNA條帶。

2.3 重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的構(gòu)建:

將p EGFP-N1質(zhì)粒和CPNE3基因PCR產(chǎn)物，分別用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，膠回收純化酶切產(chǎn)物，并用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素抗性篩選陽性集落，并抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證。將篩選到的陽性集落送測序。將測序正確的陽性集落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集菌體，按高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書操作提取質(zhì)粒，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞:

293T和H1299細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，消化并接種6孔板。待細(xì)胞生長至60%匯合時，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent轉(zhuǎn)染說明，進(jìn)行p EGFP-N1質(zhì)粒和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

2.5 細(xì)胞爬片:

293T和H1299細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含雙抗和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，消化并接種于放有細(xì)胞爬片的24孔板中。待細(xì)胞生長至60%匯合時，按LTX with PlusTMReagent轉(zhuǎn)染說明，進(jìn)行p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，對照組為p EGFP-N1質(zhì)粒。

2.6 激光掃描共焦檢測:

在2.5中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，加入4%多聚甲醛固定10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清室溫封閉1 h。GAPDH抗體用2%羊血清按1∶100稀釋，滴加于爬片上，4℃孵育過夜。PBST漂洗爬片3次，每次5 min。羅丹明標(biāo)記的熒光二抗(1∶100)室溫避光孵育2 h,PBST漂洗3次。在載玻片上滴加含DAPI的封片劑，將爬片反扣在封片劑上，用中性樹脂在爬片四周經(jīng)行封固。選擇405nm激發(fā)光檢測DAPI,488 nm激發(fā)光檢測EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激發(fā)光檢測GAPDH。在激光掃描共焦顯微鏡下觀察并攝片。

2.7亞細(xì)胞組分離:

在2.4中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS清洗兩次，0.25%胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞。使用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒，對細(xì)胞亞組份進(jìn)行分離。步驟:向收集的細(xì)胞中加入200μl細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑A，劇烈渦旋使細(xì)胞完全散開，冰浴15 min。加入10μl抽提試劑B，渦旋混勻5 s，冰浴1 min，再次渦旋5 s。4℃，12 000 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，得到胞質(zhì)蛋白。向沉淀中加入50μl細(xì)胞核蛋白抽提試劑，渦旋混勻30 s，冰浴30 min，期間每隔1～2 min渦旋混勻30 s。4℃，12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的EP管中，得到細(xì)胞核蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，用于后續(xù)Western blotting檢測。

2.8 Western blotting檢測:

分別取40μg胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，100 V恒壓濕轉(zhuǎn)1 h至0.2μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,PBST(含0.5%吐溫20的PBS溶液)洗膜3次。加入Copine-3抗體(1∶1000),4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次8 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室溫孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每次8 min。向PVDF膜上均勻滴加ECL發(fā)光液，于暗房內(nèi)顯影。

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