2.9 免疫組織化學(xué)檢測(cè):

組織芯片經(jīng)脫蠟水化、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶、熱抗原修復(fù)和BSA封閉后，Copine-3抗體1∶500稀釋后滴加于芯片，4℃孵育過(guò)夜。按GTVisionⅢ型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，滴加HRP標(biāo)記的聚合物(抗兔/鼠)室溫孵育40 min,DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染5 min，自來(lái)水沖洗10 min返藍(lán)，鹽酸乙醇分化10 s，脫水透明后封片光學(xué)顯微鏡下檢查。

結(jié)果

1．細(xì)胞總RNA提取及CPNE3基因擴(kuò)增

如圖1所示，使用總RNA提取試劑盒提取HBE的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，3條RNA條帶較為清晰、完整，沒(méi)有明顯彌散、降解現(xiàn)象，表明提取的RNA質(zhì)量較好。

使用隨機(jī)引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA。以c DNA為模板，利用合成的CPNE3基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與預(yù)期分子量大小相同的條帶(約1600 bp)。

2．重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3經(jīng)XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，其中1條片段(約1600 bp)與目的基因大小一致，另1條片段(約5000 bp)與p EGFP-N1質(zhì)粒雙酶切后大小一致(圖2)。

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果經(jīng)生物大分子序列比對(duì)搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對(duì)，插入片段與目的基因序列一致。表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3。

3．熒光倒置顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，分別轉(zhuǎn)染p EGFP-N1質(zhì)粒的對(duì)照組和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均有綠色熒光。表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功并表達(dá)EGFP(圖3)。

4．激光掃描共焦顯微鏡觀察

p EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T和H1299細(xì)胞中，EGFP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)分布均勻;重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在激光掃描共焦顯微鏡下可以觀察到，綠色的Copine-3-EGFP與紅色的GAPDH，以及藍(lán)色的DAPI均有重合，表明Copine-3-EGFP融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖4)。

5．光學(xué)顯微鏡觀察

分別收集正常培養(yǎng)的293T和H1299細(xì)胞，按步驟2.7操作，在加入抽提試劑B處理前后分別取樣經(jīng)結(jié)晶紫染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。加入抽提試劑B前，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可觀察到完整的細(xì)胞;加入抽提試劑B后，細(xì)胞膜在低滲透壓條件下膨脹破裂，完整的細(xì)胞核被分離出來(lái)(圖5)。表明該方法適用于胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白的分離。

6. Western blotting檢測(cè)Copine-3蛋白表達(dá)

分別提取轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的293T和H1299細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核胞核蛋白，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。骨架蛋白β-actin和組蛋白Histon H1分別在胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白中被檢測(cè)到;在胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白中均檢測(cè)到Copine-3蛋白。表明Copine-3蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖6)。

7．免疫組織化學(xué)觀察

對(duì)肺腺癌組織臨床樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖7，箭頭所示，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有棕色顯色，Copine-3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

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