目的：建立超高效液相色譜（UPLC）-生物化學(xué)檢測(cè)（BCD）在線聯(lián)用技術(shù)快速篩選中藥中的丁酰膽堿酯酯酶（BChE）抑制劑的方法。方法：運(yùn)用UPLC-DAD-BCD方法快速篩選吳茱萸、鉤藤、苦參、山豆根提取物中的BChE抑制劑。以蓮心堿為陽性對(duì)照，考察UPLC-DAD-BCD方法用于BChE抑制劑篩選的可行性。運(yùn)用超高效液相-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-LTQ/Orbitrap MS）方法鑒定4種中藥的70%甲醇提取物中的主要活性成分。結(jié)果：UPLC-DAD-BCD方法快速篩選出12個(gè)BChE抑制劑，其中吳茱萸4個(gè)、鉤藤3個(gè)、苦參5個(gè)、山豆根2個(gè)，山豆根中的2個(gè)活性成分與苦參共有，通過UHPLC-LTQ/Orbitrap MS鑒定出其中的8個(gè)BChE抑制劑，分別為去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、1-甲基-2--4(1H)-喹諾酮、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、苦參堿和氧化苦參堿。結(jié)論：建立的UPLC-DAD-BCD在線分析方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，能快速篩選中藥中的BChE抑制劑，為中藥中新的生物活性成分的快速篩選提供了一種高效、便捷的分析策略。

阿爾茨海默病( Alzheimer’s disease，AD）是以進(jìn)行性的記憶喪失和認(rèn)知障礙為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。目前，AD的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。AD 的發(fā)病與演進(jìn)過程中，膽堿能系統(tǒng)受損乃至乙酰膽堿( ACh)的減少與認(rèn)知功能下降直接相關(guān)，因此，膽堿酯酶抑制劑常用于AD臨床患者的治療。

目前，用于臨床的膽堿酯酶抑制劑多為AChE抑制劑，外周副作用較大，長(zhǎng)期治療效果不理想。研究表明，在人體中有2種乙酰膽堿水解酶，即乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），健康人大腦中主要由AChE代謝乙酰膽堿，BChE的含量極少，而AD患者腦中的情況正好相反，AChE活性下降而BChE活性升高。研究顯示，BChE抑制劑不僅能夠提高乙酰膽堿水平，改善大鼠記憶，且少有或沒有AChE引起的外周膽堿能副作用。故與AChE相比，BChE可能是一個(gè)更合適的AD治療靶點(diǎn)，并在AD 中具有重要作用。已經(jīng)上市用于治療AD的藥物大多都是生物堿類成分，吳茱萸、鉤藤、苦參和山豆根中都富含生物堿，可用BChE抑制劑的篩選。

近年來，研究者致力于從天然產(chǎn)物中尋找毒副作用小的膽堿酯酶抑制劑，已發(fā)現(xiàn)的一些活性成分有生物堿類、黃酮類、香豆素和萜類等，其中以生物堿為主。從植物中篩選選擇性強(qiáng)、毒副作用小的膽堿酯酶抑制劑已成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。為了快速篩選復(fù)雜基質(zhì)中的活性物質(zhì)，各種在線分析方法已經(jīng)被建立并被應(yīng)用，如：HPLC-UV-DPPH用于地黃中的抗氧化劑的篩選和活性評(píng)價(jià)，HPLC-UV-AChE方法可快速檢測(cè)銀杏提取物于中的AChE抑制劑，HPLC-BCD方法用于檢測(cè)綠茶中的α-葡萄糖苷酶抑制劑等。

本研究以蓮心堿為陽性對(duì)照品，優(yōu)化儀器聯(lián)用系統(tǒng)，建立在線UPLC-DAD-BCD分析方法，快速篩選中藥中BChE抑制劑，為中藥中活性物質(zhì)的快速篩選提供一種高效、便捷的分析策略。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀UPLC（PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；Ultimate 3000 UHPLC（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Thermo Scientific LTQ-Orbitrap Elite組合式高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；柱后衍生儀（PCX）（美國(guó)Pickering Laboratcries公司）；Milli-Q 超純水凈化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Metter Toledo AL204電子天平（上海速展計(jì)量?jī)x器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；WD-94158型超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

吳茱萸（貴州，批號(hào)1907051）、鉤藤（廣西，批號(hào)18120081）、苦參（江蘇，批號(hào)B2101009）和山豆根（廣西，批號(hào)181201）藥材飲片購于湖北武漢老百姓大藥房，經(jīng)湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院丁曉萍研究員鑒定分為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth的干燥果實(shí)、茜草科植物鉤藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.的干燥帶鉤莖枝、豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根和豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖。

乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)，J.T.Baker）；5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB) (美國(guó)Sigam，批號(hào) SHBG2823V )、碘化硫代丁酰膽堿（BTCI）（美國(guó)Sigam公司，批號(hào)BCBT4812）；BChE（美國(guó)Sigam公司，批號(hào)SLBP0912V）；牛血清蛋白（美國(guó)Sigam公司，批號(hào) SLBL2616V）；超純水（Milli-Q超純水純化系統(tǒng)自制）；甲醇、三甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。蓮心堿（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)111696-201703）。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

分別精密稱取吳茱萸、鉤藤、苦參、山豆根粉末4 g，于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，稱定重量，超聲（功率350 W，頻率35 kHz）30 min，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

精密稱取蓮心堿高氯酸鹽，用色譜甲醇制備成濃度為0.06，0.12，0.24，0.36，0.60，1.20和1.80 mg·mL-1的溶液，直接進(jìn)樣。

2.2 BChE溶液和基質(zhì)溶液的制備

用0.1 moL·L-1 0.1%牛血清蛋白的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）制備0.3 U·mL-1的BChE溶液；精密稱取DTNB粉末適量，用Tris-HCl緩沖液（0.1 moL·L-1、pH 8.0）制備成1.5×10-3 moL·L-1的溶液；精密稱取BTCI粉末適量，用Tris-HCl緩沖液（0.1 moL·L-1、pH 8.0）制備成3×10-3 moL·L-1的溶液。

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