高脂飲食可導致血脂升高，嚴重時可引起一些危害人體健康的疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎等，已成為現(xiàn)代社會人群主要的營養(yǎng)問題之一。此外，長期食用高脂膳食還可導致體脂異常積累和腸道微生物群的不平衡。通過飲食干預預防由高脂飲食引起的健康問題正成為研究的熱點。

抗性淀粉在小腸中難以被酶解吸收，而在大腸中可被酵解，其通過上消化道進入大腸，經(jīng)細菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血糖和膽固醇，抑制脂肪的吸收積累，改善慢性炎癥。盲腸是大腸的起始段，雖然盲腸、結(jié)腸是細菌最密集和多樣的區(qū)域，且二者內(nèi)容物中菌群結(jié)構(gòu)具有相似性，但是優(yōu)勢菌群存在差異。目前關于盲腸中菌群變化特征與改善因高脂飲食誘導高血脂和高血糖關系的研究少有報道。紫山藥（PurpleDioscoreaalataL）為多年生藤本植物薯蕷（DioscoreaalataL）的塊莖，在我國南方地區(qū)廣泛種植，淀粉約占生物總量的16%～20%。

本研究以紫山藥高抗性淀粉為原料，揭示紫山藥高抗性淀粉對盲腸微生物的益生作用及其改善高血脂癥效能，可為盲腸菌群及脂質(zhì)代謝與健康的研究提供依據(jù)。

1材料和設備

1.1材料與試劑

紫山藥（紫玉淮山），產(chǎn)自福建省三明市建寧縣。普魯蘭酶（2800U/g）、高溫α-淀粉酶（8000U/mL），美國Sigma公司；淀粉葡糖苷酶（100000U/mL），上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖檢測試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；血脂試劑盒，南京建成生物工程研究所；ＴIANampStoolDNAkit試劑盒，天根生化科技有限公司；檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純?；A飼料成分：碳水化合物72.3%、蛋白質(zhì)14.9%、脂肪12.8%；高脂飼料成分：氫化椰子油5%，玉米油5%，膽固醇0.2%和基礎飼料89.8%。飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2主要設備與儀器

DHG-9003A型熱風干燥箱，上海精宏試驗設備有限公司；SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ＴDL-5-A型低速離心機，上海安亭科學儀器廠；ＶERＴEX70型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克分析儀器公司；GA-3型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；PE300型IlluminaMiSeq測序儀，美國Illumina公司。

2試驗方法

2.1紫山藥抗性淀粉的制備

紫山藥淀粉的制備見文獻。將50.0g紫山藥淀粉（干基），加至200mL磷酸緩沖溶液（0.2mol/L，pH5.0）中煮沸30min，降溫至58℃；加入普魯蘭酶（2800U/g）攪拌12h；調(diào)節(jié)至7.0，120℃保溫30min，冷卻至4℃貯藏24h，反復2次；將沉淀粉40℃干燥后，稱取20.0g加入100mLpH6.0乙酸鈉緩沖溶液，升溫至90℃，加入0.3mL高溫α-淀粉酶（8000U/mL）保持1h，冷卻至60℃并用稀釋的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.3mL淀粉葡糖苷酶（100000U/mL）保持1h；以3000×g離心15min，蒸餾水洗滌淀粉3次，體積分數(shù)95%乙醇洗滌3次，40℃干燥24h，粉碎過100目篩，得高抗性淀粉（HRS）。經(jīng)檢測，HRS中的快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉的含量分別為11.4%，28.4%和60.2%。

2.2 FTlR分析

傅里葉變換紅外光譜（FＴIR）分析根據(jù)Wang等的方法稍做修改。將干燥的HRS樣品與溴化鉀以1∶100～1∶150的比例進行混合，充分研磨。將研磨好的粉末倒入模具中抽真空壓片，12MPa的壓力下保持30s，壓至透明，在4000～400cm^-1掃描范圍內(nèi)利用傅里葉變換紅外光譜掃描儀觀察。

2.3動物模型建立

雄性金黃地鼠，SPF級，6～8周齡，體重90～110g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。適應性喂養(yǎng)1周后，將32只金黃地鼠隨機分為4組飼喂：正常對照組（NC）：基礎飼料+等量生理鹽水；模型組（MC）：高脂飼料+等量生理鹽水；HRS低劑量組（LR）：高脂飼料+0.5g/100gbw高抗性淀粉；HRS高劑量組（HR）：高脂飼料+1.5g/100gbw高抗性淀粉。金黃地鼠自由采食、飲水，10h/14h白晝交替喂養(yǎng)4周。

2.4盲腸內(nèi)容物收集

在第2和第4個周末禁食12h，各試驗組分別宰殺3只和5只金黃地鼠，收集盲腸內(nèi)容物包裝后于-80℃冷凍。

2.5血清指標測定和臟器變化

在第4周末眼眶取血后處死，快速剝離肝臟、腎臟、脾臟、附睪和腎周的脂肪組織并稱重；將血液收集在采血管中，于4000r/min、4℃離心15min，血清分裝在1.5mL離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?；按照血脂測定試劑盒說明書測定甘油三脂（ＴG）、總膽固醇（ＴC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度。

2.6 DNA提取和16SrDNA基因PCR擴增

使用ＴIANampStoolDNAkit試劑盒從金黃地鼠盲腸內(nèi)容物中提取DNA。以盲腸內(nèi)容物中細菌基因組為模板，以520F和802R為上下游引物，擴增16SrDNA的Ｖ4區(qū)。其中，PCR反應體系（50μL）：10×Ｔaqbuffer5μL；dNＴP5μL；上游引物515F（20μmol/L）0.5μL；下游引物806R（20μmol/L）0.5μL；Ｔaq酶0.5μL；模板1μL；ddH2O37.5μL。PCR反應條件：94℃3min；94℃45s，50℃60s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃10min。

2.7測序數(shù)據(jù)的生物信息分析

采用Illumina公司的ＴruSeqNanoDNALＴLibraryPrepKit制備測序文庫，在IlluminaMiseq測序儀上進行測序；將測序條帶拼接，按照與參照序列≥97%的相似度聚類，建立OＴU，并確定種系型。利用熱圖和分類組成分析（LEfSe分析）分別研究金黃地鼠盲腸菌群豐度和分類組成的變化。

2.8統(tǒng)計分析

所有檢測一式3份，采用DPS8.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表示為：平均值±標準偏差。方差分析按5%顯著性水平進行。

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