復(fù)方羅布麻片Ⅰ是由羅布麻葉、野菊花、防己3味中藥及泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6、維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、鹽酸異丙嗪組方的復(fù)方制劑，是臨床常用降血壓藥，藥效協(xié)同，成分復(fù)雜?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有氫氯噻嗪的含量測(cè)定和鹽酸異丙嗪的薄層鑒別，過(guò)于簡(jiǎn)單，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。本研究中參考文獻(xiàn)，分析了極性及穩(wěn)定性等性質(zhì)來(lái)確定溶劑、固定相及流動(dòng)相，最終采用高效液相色譜雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定該復(fù)方制劑中泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀，配有LC-20AD型紫外可見(jiàn)光度檢測(cè)器(日本島津公司);Elmasonic P 60H型超聲儀(德國(guó)Elmasonic公司，功率為320 W，頻率為80 k Hz);XS-105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一);BINDER PD60型電熱干燥箱(德國(guó)Binder公司)。

1.2 試藥

泛酸鈣對(duì)照品(批號(hào)為100370-201402，純度為97.5%)，氫氯噻嗪對(duì)照品(批號(hào)為100309-201103，純度為99.8%)，維生素B6對(duì)照品(批號(hào)為100116-201103，純度為99.9%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;復(fù)方羅布麻片Ⅰ(某藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)分別為151001,151002,151003);庚烷磺酸鈉、乙腈、甲醇均為色譜純，水和冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:0.12%庚烷磺酸鈉(A，冰醋酸調(diào)p H至3.0)-乙腈(B)，梯度洗脫(程序見(jiàn)表1);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):泛酸鈣200 nm，其他275 nm;進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液制備

對(duì)照品貯備液:取泛酸鈣對(duì)照品12.5 mg，氫氯噻嗪對(duì)照品16.0 mg，維生素B6對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，分別置50 mL,10 mL,25 mL容量瓶中，泛酸鈣和維生素B6加流動(dòng)相溶解稀釋，氫氯噻嗪先加2 mL甲醇超聲溶解，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備液A,B,C。

對(duì)照品溶液:精密量取上述對(duì)照品貯備液A,B,C各1 mL，分別置10,100,10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液A,B,C。

供試品溶液:取本品20片，研細(xì)，取粉末適量(約相當(dāng)于氫氯噻嗪3.2 mg)精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，加流動(dòng)相適量，超聲處理30 min，使其溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，過(guò)濾，即得。

陰性對(duì)照品溶液:按處方比例制備不含泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察及檢測(cè)限與定量限測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品貯備液A,B,C各1,3,5,10,15,20 mL，分別置50 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。分別以信噪比(S/N)為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)測(cè)得各化合物的檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

精密度試驗(yàn):分別精密量取上述對(duì)照品溶液A,B,C各20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為0.34%,0.12%,0.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于0,3,6,9,12,24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為1.18%,0.35%,0.31%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為151001)樣品6份，依法制備供試品溶液，以外標(biāo)法計(jì)算泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量。結(jié)果含量的RSD分別為0.31%,0.29%,0.53%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的同一批(批號(hào)為151001)樣品1片，研細(xì)取粉末，置50 mL容量瓶中，依法制備供試品溶液，分別加入對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣20μL，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品(批號(hào)分別為151001,151002,151003)，依法制備供試品溶液，分別精密量取20μL，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批樣品中泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6的平均含量分別為43.26%,95.54%,52.38%。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

曾比較Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Agilent 5HC C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),Waters Symmetry Shield C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的色譜圖，以分離度為優(yōu)化指標(biāo)，結(jié)果4種色譜柱的分離度分別為3.125,1.875,3.075,1.950，故色譜柱選擇Kromasil C18柱。

3.2 溶劑選擇

參考文獻(xiàn)，氫氯噻嗪在水中不溶，在乙醇中微溶。流動(dòng)相中有機(jī)相比例小，故先采用適量甲醇超聲溶解，加流動(dòng)相定容。泛酸鈣極不穩(wěn)定，易降解，水溶液中顯中性或弱堿性，流動(dòng)相為酸性環(huán)境，故泛酸鈣極易降解，需要及時(shí)配制。樣品中含有多種中藥，成分復(fù)雜，且流動(dòng)相中離子對(duì)濃度大，故應(yīng)對(duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù)。

3.3 波長(zhǎng)選擇

因泛酸鈣無(wú)最大吸收波長(zhǎng)，故于200 nm波長(zhǎng)處末端吸收測(cè)定含量，另2種物質(zhì)氫氯噻嗪和維生素B6的最大吸收波長(zhǎng)分別為271 nm和291 nm。考慮到含量測(cè)定的均衡性，確定測(cè)定波長(zhǎng)為275 nm。因此，泛酸鈣測(cè)定波長(zhǎng)選擇200 nm，氫氯噻嗪和維生素B6測(cè)定波長(zhǎng)選擇275 nm。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的高效液相色譜雙波長(zhǎng)法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中3組分的含量，簡(jiǎn)便易行，可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方羅布麻片Ⅰ中泛酸鈣、氫氯噻嗪和維生素B6的含量測(cè)定。

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