1.6.2.3熒光定量PCR

根據(jù)TBGREENTMpREMIxExTAQTMⅡ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，每樣3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系共20μL：CdNA樣2μL；uNIvERsdlsyBRGREEN100μL；上、下游引物各1.5μL；FREEWATER5μL。擴(kuò)增條件的程序設(shè)置：98℃2MIN；95℃100s，60℃45s循環(huán)40次；90℃90s；60℃3MIN；94℃100s。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR儀自帶的AB17300sdssoFTｗARE分析軟件分析所得結(jié)果CT值。目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量用2－△△CT計(jì)算，最終結(jié)果以GRApHpAdpRIsM5軟件作圖表示。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用ExCE12013軟件進(jìn)行整理，采用spss22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)用duNCAN氏進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果與分析

2.1復(fù)方中草藥對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)前期（0～21d），B組肉雞平均日采食量顯著高于A組和F組（P＜0.05），且其平均日增質(zhì)量顯著高于除C組和E組外的其他各組（P＜0.05）。試驗(yàn)后期（22～42d），C組肉雞平均日采食量和平均日增質(zhì)量均顯著高于A組和E組（P＜0.05），B組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組、E組和F組（P＜0.05）。從全期（0～42d）看，各處理組肉雞平均日采食量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但B組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組、d組和F組（P＜0.05），且C組、E組、G組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組（P＜0.05），而A組肉雞料質(zhì)量比顯著高于B組、C組和E組（P＜0.05），B組肉雞料質(zhì)量比顯著低于d組和F組（P＜0.05）。

2.2復(fù)方中草藥對(duì)肉雞免疫器官的影響

如表4所示，對(duì)于胸腺指數(shù)而言，B組顯著高于C組和E組外的其他各組（P＜0.05），而C組和E組顯著高于A組（P＜0.05）。B組脾臟指數(shù)也顯著高于除C組和E組的其他各組（P＜0.05），而C組、E組和G組均顯著高于A組（P＜0.05）。各組間法氏囊指數(shù)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3復(fù)方中草藥制劑對(duì)肉雞血液細(xì)胞因子mRNA的影響

結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在試驗(yàn)期內(nèi)均有上升趨勢(shì)，而IL-100呈下降趨勢(shì)。試驗(yàn)組IL-2、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在試驗(yàn)期內(nèi)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），整體呈上升趨勢(shì)；IL-6mRNA在28d和35d時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），呈上升趨勢(shì)；而試驗(yàn)組IL-100mRNA在28d和42d時(shí)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），呈下降趨勢(shì)。總體來(lái)看，在飼糧中持續(xù)添加復(fù)方中草藥可顯著提高肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4mRNA表達(dá)量（P＜0.05），并顯著降低血液IL-100mRNA的表達(dá)豐度（P＜0.05）。
 

3.討論

飼糧中添加復(fù)方中草藥能有效提升肉雞生產(chǎn)性能已被國(guó)內(nèi)外多數(shù)試驗(yàn)所證實(shí)，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)接受并通過(guò)中草藥添加劑來(lái)提升肉雞生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)前期結(jié)果顯示，B組平均日增質(zhì)量與平均日采食量均顯著高于其他各組，再次證實(shí)了抗生素提高肉雞生長(zhǎng)性能的效果。后期B組平均日增質(zhì)量和平均日采食量與C組、d組和G組均無(wú)顯著性差異，表明飼糧添加復(fù)方中草藥與添加抗生素對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)促進(jìn)效果一致。全期結(jié)果顯示各組平均日采食量均無(wú)顯著差異，平均日增質(zhì)量結(jié)果B組、C組、E組優(yōu)于其余各組，但料質(zhì)量比C組最低，其結(jié)果表明C組添加效果優(yōu)于B組。唐日益等研究復(fù)方中草藥添加劑（HMA）對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響，分別以連續(xù)和隔周在基礎(chǔ)飼糧中添加2kg/THMA為試驗(yàn)組，結(jié)果顯示復(fù)方中草藥添加劑對(duì)生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)均有改善作用，且連續(xù)飼喂復(fù)方中草藥添加劑效果較好，本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。劉硯涵等研究中草藥飼料添加劑對(duì)‘北京鴨’生產(chǎn)性能、免疫指標(biāo)及肉品質(zhì)的影響，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.1％（低劑量組）、0.2％（中劑量組）及0.5％（高劑量組）的復(fù)方中草藥，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中草藥顯著提高北京鴨生長(zhǎng)性能、屠宰性能，尤以0.2％的中草藥添加量效果最好。本試驗(yàn)E組與G組各項(xiàng)生長(zhǎng)性能檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)顯著差異，說(shuō)明低劑量添加就可達(dá)到高劑量的添加效果。對(duì)于復(fù)方中草藥的配伍及添加量還需更多有力數(shù)據(jù)支撐，復(fù)方中草藥添加效果是否優(yōu)于抗生素還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行考證。

禽類的免疫器官主要有法氏囊、胸腺和脾臟，其中法氏囊和胸腺是禽類的中樞免疫器官，脾臟是禽類的次級(jí)免疫器官。免疫器官的發(fā)育狀態(tài)和功能直接決定著家禽的免疫水平，其良好的發(fā)育能有效降低肉雞的發(fā)病率，減少藥物的使用，保證肉制品的質(zhì)量和安全。女貞子所含的路類及苯芒醇巧類物質(zhì)具有補(bǔ)肝補(bǔ)腎、清虛熱的作用；板藍(lán)根當(dāng)中所含有的黃酬類和三瞄皂巧類生物活性物質(zhì)具有清熱解毒的作用；當(dāng)歸中含有的當(dāng)歸多糖和揮發(fā)油具有補(bǔ)血活血、潤(rùn)燥滑腸作用；柴胡中所含的皂苷能抑制各種炎癥因子引起的踝關(guān)節(jié)腫脹和結(jié)締組織增生性炎癥。將其加入肉雞基礎(chǔ)飼糧，可有效改善肉雞免疫器官的發(fā)育。蔡晴霞等比較4種復(fù)方中藥添加劑對(duì)肉雞生產(chǎn)性能與免疫性能的影響，4個(gè)試驗(yàn)組以拌料法和飲水法給藥，測(cè)定不同日齡肉雞免疫器官指數(shù)，結(jié)果顯示復(fù)方中藥2組可提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。楊潤(rùn)霞等研究3種中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞免疫器官發(fā)育及免疫功能的影響，以黃芪、白術(shù)、防風(fēng)等單味中藥組成3組中藥復(fù)方中草藥制劑，分別于42、52、62日齡對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組雛雞胸腺、法氏囊發(fā)育良好，無(wú)明顯衰老癥狀。其結(jié)果與本試驗(yàn)存在差異，可能與中草藥配方、基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平、飼養(yǎng)環(huán)境不同等因素密切相關(guān)。總體而言，復(fù)方中草藥對(duì)肉雞免疫器官的發(fā)育有促進(jìn)作用。

IL-2又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以激活T細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體分泌以及巨噬細(xì)胞的活化。IL-6主要能刺激活化的B細(xì)胞增殖和分泌抗體，刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白并參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血細(xì)胞的發(fā)育。IL-8的主要生物學(xué)活性是吸引和激活中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞與IL-8接觸后發(fā)生形態(tài)變化，遷移到反應(yīng)部位，釋放出一系列活性產(chǎn)物。這些作用可導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的。IL-100可通過(guò)活化的T細(xì)胞抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此被稱為細(xì)胞因子合成抑制劑（CyTokINEsyNTHEsIsINHIBIToR，CsIF），特別是通過(guò)TH1細(xì)胞抑制IL-2、IFN-、LT等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。TLR3信號(hào)通路可促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，在宿主抵抗活性病毒中發(fā)揮重要作用。TLR4受體在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，例如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。TLR可識(shí)別病毒囊膜蛋白，然后與病原分子結(jié)合，從而啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，最終引起趨化因子和炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗感染作用。寡糖、植物精油和微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)肉雞體內(nèi)部分基因IL及TLRsmRNA的表達(dá)已被多位學(xué)者早期證實(shí)，但目前關(guān)于復(fù)方中草藥對(duì)肉雞天然免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響報(bào)道較少。馬景番等探討不結(jié)球白菜提取物（NCCE）對(duì)肉雞脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)豐度的影響，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量的NCCE，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NCCE能夠誘導(dǎo)肉雞脾臟IL-2、IL-4及IFNγmRNA的表達(dá)，以添加500MG/kg效果最好。熊阿玲等探討不同水平的MOS對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能等的影響，天然免疫相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，飼糧添加MOS顯著影響肉雞組織TLR2和TLR4mRNA的表達(dá)。本試驗(yàn)在基礎(chǔ)飼糧中持續(xù)添加復(fù)方中草藥，肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3和TLR4基因mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并在試驗(yàn)期內(nèi)呈顯著上升趨勢(shì)，且IL-100mRNA表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步說(shuō)明了中草藥制劑也同樣具有增強(qiáng)免疫的功效。

4.結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，飼糧添加復(fù)方中草藥可提高肉雞生產(chǎn)性能、促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，且在14～42日齡添加100mL/kg復(fù)方中藥制劑提取物效果最佳；持續(xù)添加復(fù)方中藥制劑提取物可上調(diào)基因IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4mRNA的表達(dá)，下調(diào)IL100mRNA的表達(dá)。

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