(2)測(cè)定

①微管柱的制備：以少量脫脂棉作底用鐵絲扎實(shí)，置于微管柱管架上，依次加入高為0.5cm無水硫酸鈉(80～100目)、0.5cm硅鎂型吸附劑、0.5cm無水硫酸鈉(80～100目)、1.5cm中性氧化鋁，1.5cm酸性氧化鋁、3cm無水硫酸鈉(40～80目)，頂部以少量脫脂棉堵塞，裝試劑時(shí)管要垂直，每裝一種試劑要適當(dāng)敲緊，兩種試劑之間界面要平齊，柱管要隨裝隨用，以免在空氣中吸水活性下降。

②微柱色譜：在裝好的微柱中，加入三氯甲烷提取液1.0mL，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)管，另取三支微管柱，各加入三氯甲烷1.0mL，再分別加入黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)液(0.1μg/mL)0pL、50μL、100μL，相當(dāng)于黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)0ng、5ng、10ng，待加液流制頂層時(shí)，即加入1.0mL丙酮-三氯甲烷(1+9)展開劑，在加樣或展開時(shí)，柱管均要保持垂直，待展開劑流完后，即可觀察結(jié)果。

③結(jié)果觀察與評(píng)定：于波長(zhǎng)365nm紫外光燈下觀察，將色譜分離后的樣品管依次與0μg、5μg、10μng黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)管比較。若試樣柱管內(nèi)硅鎂型吸附層與0管一致，則為陰性(在5μg/kg以下)；如試樣管中硅鎂型吸附層呈藍(lán)紫色熒光環(huán)，則為陽(yáng)性，并需進(jìn)一步按薄層色譜法進(jìn)行確證測(cè)定，但不需重新提取試樣。其操作為：準(zhǔn)確吸取原三氯甲烷提取液4.0mL(相當(dāng)于4g或8g試樣)于小蒸發(fā)皿內(nèi)揮干，以少量苯-乙腈混合液(98+2)分?jǐn)?shù)次轉(zhuǎn)入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混勻，按薄層色譜法確證，并測(cè)定黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₃、黃曲霉毒素G₂的含量。

(三)高效液相色譜法

1、原理

試樣經(jīng)乙腈-水提取，提取液過濾后，經(jīng)裝有反相離子交換吸附劑的多功能凈化柱，去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。凈化液中的黃曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用帶有熒光檢測(cè)器的液相色譜系統(tǒng)分析，外標(biāo)法定量。

2、試劑和材料

①黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素島、黃曲霉毒素G₂、黃曲霉毒素G₂的標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99%。

②乙腈：色譜純、分析純。

③三氟乙酸：分析純。

④ 己烷分析純。

⑤ 水：電導(dǎo)率(25℃)≥0.01mS/m。

⑥ 乙腈-水(84+16)提取液：量取乙腈(分析純)840mL，加水160mL，混勻。

⑦ 水-乙腈(85+15)溶液：量取乙腈(色譜純)150mL，加三蒸水850mL，混勻。

⑧ 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂ 0.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g(精確至0.001g)，置10mL容量瓶中，加乙腈(分析純)溶解，并稀釋至刻度。此溶液密封后避光-30℃保存，2年有效。

⑨標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00μL，至10mL容量瓶中，加乙腈(分析純)稀釋至刻度。此溶液密封后避光4℃保存，3個(gè)月有效。

⑩準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，至10mL容量瓶中，加乙腈(分析純)稀釋至刻度(含黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素G_l的濃度為0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₂的濃度為0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液)，注意避光。

3、儀器和設(shè)備

①液相色譜系統(tǒng)(HPLC)：附熒光檢測(cè)器。

②色譜柱：反相C₁₈柱，要求4種毒素的峰能夠達(dá)到基線分離。

③含有反相離子交換吸附劑的多功能凈化柱：Mycosep^TM226MFC柱或Mycosep^TM228MFC柱(或其他等效產(chǎn)品)。

④電動(dòng)振蕩器。

⑤漩渦混合器。

⑥烘干箱。

⑦離心機(jī)。

⑧真空吹干機(jī)，或氮?dú)饧八″仭?/p>

⑨天平：感量為萬(wàn)分之一。

4、分析步驟

(1)試樣提?。悍Q取20g經(jīng)充分粉碎過的試樣至250mL錐形瓶中，加入80mL乙腈-水(84+16)提取液，在電動(dòng)振蕩器上振蕩30min后，定性濾紙過濾，收集濾液。

(2)試樣凈化：移取約8mL提取液至多功能凈化柱的收集池中。

(3)試樣衍生化：從多功能凈化柱的收集池內(nèi)轉(zhuǎn)移2mL凈化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干機(jī)下60℃±1℃吹干(或在60°C：水浴下氮?dú)獯蹈?，注意不要使液體鼓泡、飛濺)。加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30s后，在40℃±1℃烘干箱中衍生15min。室溫真空吹干機(jī)吹干(或室溫水浴下氮?dú)獯蹈?，以200μL水-乙腈(85+15)溶解，混勻30s，1000r/min離心15min，取上清液至液相色譜儀的樣品瓶中，供測(cè)定用。

(4)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各200μL，在真空吹干機(jī)下60℃吹干(或在60℃水浴下氮?dú)獯蹈?，注意不要使液體鼓泡、飛濺)，衍生化方法同(3)。

(5)測(cè)定

①色譜條件

a．色譜柱 12.5cm×2.1mm，5μm，C₁₈。柱溫30℃。

b．流動(dòng)相 乙腈(色譜純)，水，梯度洗脫的變化參考下表。調(diào)整洗脫梯度，使4種黃曲霉毒素的保留時(shí)間在4～25min。

c．其他條件 流速0.5mL/min。進(jìn)樣量25μL。熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)360nm；發(fā)射波長(zhǎng)440nm。

②測(cè)定：黃曲霉毒素按照黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂的順序出峰，以標(biāo)準(zhǔn)系列的峰面積-濃度分別繪制每種黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣通過與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖保留時(shí)間的比較，確定每一種黃曲霉毒素的峰，根據(jù)每種黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及試樣中的峰面積，計(jì)算試樣中各種黃曲霉毒素含量。

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