2、丁酰膽堿酯酶活性抑制分析的分光光度法：丁酰膽堿酯酶活性抑制法的分光光度法采用國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》(GB／T 5009.199—2003)。在試管中加入用磷酸鹽緩沖液提取法提取的蔬菜樣品提取液2.5 mL(空白對照管加2.5 mL磷酸鹽緩沖液)，然后分別加人O.1mL丁酰膽堿酯酶液和0.1mL顯色液(取160mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6mg NaHCO2，用20mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液溶解)，混勻后37℃反應(yīng)15min以上，加入0.1mL底物液(25 mg碘化硫代丁酰膽堿溶于3mL蒸餾水)混勻，立即加入比色皿中，用分光光度計在412nm波長下分別測定37℃反應(yīng)3min樣品吸光度的變化值(△As)和空白吸光度的變化值(△A0)。計算酶活性被抑制的百分率，計算公式為：

當(dāng)樣品提取液對酶活性的抑制率低于15％時，表示該蔬菜為安全或比較安全；抑制率為16％～25％表示該蔬菜為輕度污染；抑制率為26％～50％時為中度污染；抑制率≥50％表示樣品中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在。對明顯呈陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢測2次以上，必要時用色譜色質(zhì)聯(lián)用等方法進(jìn)一步測定具體的農(nóng)藥品種和含量。

(二)速測卡(酶片)法

速測卡由浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類的紙片(酶片)和含酶的底物2，6-二氯靛酚乙酸酯的紙片(底物片)組成。2，6-二氯靛酚乙酸酯在膽堿酯酶的催化下能迅速發(fā)生水解反應(yīng)生成藍(lán)色的2，6-二氯靛酚，如果酶片上存在有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，膽堿酯酶活性受抑制，2，6-二氯靛酚乙酸酯不能被水解產(chǎn)生藍(lán)色的2，6-二氯靛酚，底物片不變色，如不含農(nóng)藥則顯藍(lán)色，其基本技術(shù)及原理與比色法相似，檢測靈敏度也相近。使用紙片這種簡單的載體，可以達(dá)到便于攜帶和現(xiàn)場操作的目的，不需儀器。檢測過程如圖6—2所示。

每批測定應(yīng)設(shè)緩沖液空白對照。酶片浸入或滴加樣品提取液后應(yīng)保持濕潤，無論是預(yù)反應(yīng)10min，還是酶片與底物片復(fù)合反應(yīng)3min，反應(yīng)溫度最好為37℃，溫度低時應(yīng)適當(dāng)延長反應(yīng)時間。

(三)薄層光譜酶活性抑制法

含農(nóng)藥的樣品提取液在薄層板上展開后，噴酶液至板面濕潤，在37℃、相對濕度90％的恒溫箱中放置20min，取出后噴顯色底物液，37℃保溫5min，背景呈紫紅色；有農(nóng)藥的部位由于酶活性被抑制，不能水解底物產(chǎn)生紫紅色的產(chǎn)物，板上呈現(xiàn)白色斑點，通過斑點面積法或薄層掃描法進(jìn)行定量分析。

(四)固相酶速測技術(shù)

速測片法常會遇到酶活性和靈敏度降低，測不出超標(biāo)農(nóng)藥的現(xiàn)象，有時甚至還產(chǎn)生假陽性。這是因為水果、蔬菜的提取物中含有很多對乙酰膽堿酯酶具有抑制作用的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)對乙酰膽堿酯酶的抑制作用，是通過可逆性結(jié)合來實現(xiàn)的，然而農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的抑制作用是不可逆的。因此可通過洗滌的方法把這些沒有同乙酰膽堿酯酶牢固結(jié)合的雜質(zhì)去除，要達(dá)到這一目的，酶的同定化必不可少。通過把乙酰膽堿酯酶固定在一種特殊的、不會和其活性部位發(fā)生反應(yīng)的載體上面，這樣可以通過洗滌排除雜質(zhì)對酶活性的影響，從而顯著提高檢測靈敏度，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，便于儲存。該技術(shù)的關(guān)鍵在于酶的固定化。用一種蛋白質(zhì)模板(如明膠、血清蛋白、血紅蛋白等)作為中間體，將乙酰膽堿酯酶固定在特定的支持物上(如玻璃試管等)，在固定好酶的試管中加入待測樣品溶液，溫育一定時間后傾去樣品溶液，洗滌去除雜質(zhì)，加入酶的底物和顯色劑的混合液。當(dāng)樣品中不含農(nóng)藥、固定化酶具有活性時，乙酰膽堿水解產(chǎn)物與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)，反應(yīng)液呈黃色；如果樣品中存在對酶起抑制作用的農(nóng)藥，反應(yīng)液顏色不變或顯色很淺，與標(biāo)準(zhǔn)色板對照進(jìn)行定量檢測。

(五)乙酰膽堿酯酶傳感器

乙酰膽堿酯酶傳感器是一種以固定化乙酰膽堿酯酶為生物敏感部件的生物傳感器。生物傳感器是指由一種生物敏感部件和信號轉(zhuǎn)換器緊密配合、對特定種類物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。

第一代生物傳感器是將固定了生物活性物質(zhì)(包括酶、抗體、活性細(xì)胞或組織、微生物等)的膜(通常為半透膜)覆被在電化學(xué)電極上而形成。第二代生物傳感器是將人工合成的媒介體與生物活性物質(zhì)摻和后直接吸附或共價修飾到轉(zhuǎn)換器表面而形成。第三代生物傳感器是將生物活性物質(zhì)直接固定在電子元件(如半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管)上形成，從而可以直接感知和放大界面物質(zhì)的變化，從而將生物識別與信號轉(zhuǎn)換結(jié)合在一起。由于生物傳感器可高度自動化、微型化與集成化，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、海洋、軍事等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，特別適合于現(xiàn)場和原位監(jiān)測。以乙酰膽堿酯酶為生物敏感材料的生物傳感器在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中具有較好的研究和開發(fā)應(yīng)用價值。

將乙酰膽堿酯酶通過丙烯酰胺異丁烯酰胺化學(xué)交聯(lián)固定在銥電極表面制備電位型酶傳感器，由于被測樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥濃度不同，對乙酰膽堿酯酶活性的抑制程度的不同，使酶水解底物所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物濃度不同，引起電極表面和內(nèi)部所產(chǎn)生的電位差不同，由此對被測樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行定性分析和定量分析。

采用戊二醛法將乙酰膽堿酯酶固定在由四氰基對醌二甲烷修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，研制安培型乙酰膽堿酯酶傳感器，然后用含大量非還原性多糖的酶穩(wěn)定劑進(jìn)行處理，在4℃冰箱保存一年后其活性無顯著變化。以乙酰膽堿酯酶傳感器作指示電極，Ag／Agcl電極作參比電極，硫代乙酰膽堿作乙酰膽堿酯酶的底物進(jìn)行電化學(xué)分析，乙酰膽堿酯酶水解產(chǎn)物巰基目旦堿在電極表面氧化，產(chǎn)生氧化電流。

有機(jī)磷農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致氧化電流減小。電流減小的程度以抑制百分率表示，其與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的對數(shù)在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可得到測定工作曲線。

式中，I0為未被農(nóng)藥抑制的酶電極的響應(yīng)電流，I為被農(nóng)藥抑制后的酶電極的響應(yīng)電流。

將膽堿酯酶固定在壓電晶體表面，制備壓電晶體酶傳感器，可用于對硫磷、馬拉硫磷和甲基對硫磷的測定。

乙酰膽堿酯酶傳感器可用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測定。

八、酶活性抑制分析法存在的問題

酶活性抑制分析法應(yīng)注意下述幾個主要問題。

①酶活性抑制分析法只適用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測，其靈敏度有限，且有小部分農(nóng)藥品種對此法很不靈敏，因此對檢測結(jié)果為陰性的樣品，不能認(rèn)為就不含有農(nóng)藥殘留或農(nóng)藥殘留量不超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)(MRL)。

②引起酶活性抑制分析法測定誤差的一個重要因素是某些樣品提取物中含有干擾酶活性的雜質(zhì)，從而引起測定結(jié)果的假陽性。因此對測定呈假陽性或可疑的樣本，必須進(jìn)行重復(fù)檢測，必要時對確定為陽性的樣本進(jìn)一步用色譜色質(zhì)聯(lián)用儀等儀器分析進(jìn)行確證分析。

③在生物體外許多農(nóng)藥是酶的弱抑制劑，選擇使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化劑，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槊傅膹?qiáng)抑制劑，也是改善方法靈敏度的途徑之一。

④引起酶活性抑制法測定誤差的因素還有很多，諸如酶的穩(wěn)定性、底物來源及濃度、反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時間等，因此酶活性抑制分析法測定的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性還不夠理想。

為克服多因子的影響，可考慮選擇適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑和固定化酶技術(shù)提高穩(wěn)定性，通過基因工程手段研究開發(fā)具有優(yōu)良特性的酶。

⑤由于農(nóng)藥的含量不同，對酶的抑制程度不同，不同農(nóng)藥對酶的抑制能力也有差別，因此產(chǎn)生的顏色深淺程度不同，這樣就需要按不同農(nóng)藥、不同濃度所形成顏色深淺度的不同繪制出標(biāo)準(zhǔn)色板，以便給出農(nóng)藥的大致含量。在對實驗材料、檢測方法等在比較試驗的基礎(chǔ)E，確定檢測規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。

⑥為了減少樣品提取液中的雜質(zhì)干擾，開發(fā)簡便易行的樣品凈化技術(shù)，也是減少假陽性出現(xiàn)的可選方法之一。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析