(二)乙酸-β-萘酯-固藍(lán)B鹽顯色法

此法利用底物水解產(chǎn)生的β-萘酚與固藍(lán)B鹽作用生成偶氮化合物而顯色。

(三)乙酸羥基吲哚顯色法

底物乙酸羥基吲哚水解產(chǎn)生吲哚酚，吲哚酚被氧化形成有色產(chǎn)物而顯色。

(四)乙酸靛酯顯色法

底物乙酸靛酯水解產(chǎn)生有色的產(chǎn)物靛酚藍(lán)而顯色。

(五)碘化硫代膽堿褪色法

底物碘化硫代乙酰膽堿水解生成碘化硫代膽堿，碘化硫代膽堿能使藍(lán)色的2，6-二氯靛酚還原褪色。

(六)碘化硫代丁酰膽堿顯色法

底物碘化硫代丁酰膽堿(BTCI)水解生成碘化硫代膽堿，碘化硫代膽堿與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)生成黃色溶液。

在上述顯色反應(yīng)中，乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)顯色法靈敏度不高，故很少使用。而以乙酸-β-萘酯-固藍(lán)B鹽、乙酸靛酯、吲哚乙酸酯及其衍生物為底物的顯色法靈敏度高，適應(yīng)性廣，底物和顯色劑較容易獲得，因而被廣泛應(yīng)用。

在酶活性抑制法中，影響檢測靈敏度的因素是多方面的，除底物的種類和顯色反應(yīng)類型外，酶的來源、酶與底物的配合、抑制劑的種類和性質(zhì)不同，對農(nóng)藥的檢測限、特異性和穩(wěn)定性不同。有些農(nóng)藥在生物體外是較弱的酶抑制劑，但經(jīng)過生物氧化可成為較強(qiáng)的酶抑制劑，如樂果+02→氧化樂果、對硫磷+02→對氧磷可顯著提高對乙酰膽堿酯酶(AchE)的抑制活性。依據(jù)該原理，可以采用在體外對待測農(nóng)藥進(jìn)行氧化處理等方法，使之成為較強(qiáng)的酶抑制劑，以提高對待測農(nóng)藥的檢測靈敏度。常用的處理劑有冷的發(fā)煙硝酸、稀溴水、過氧化氫、過氧乙酸、溴代琥珀酰亞胺等，或采用紫外光照射處理。

六、酶活性抑制法中的樣品制備

蔬菜、水果等新鮮農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是利用酶活性抑制法進(jìn)行快速檢測的主要對象，其目的主要是先對大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場快速篩選檢測，對不合格樣品再進(jìn)行復(fù)檢，對復(fù)檢仍不合格的少量樣品再用色譜法或色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析，以便減少實(shí)驗(yàn)室儀器分析的工作量，提高檢測效率。酶活性抑制法中蔬菜水果樣品的制備與儀器分析樣品制備相比，方法比較簡單。

(一)磷酸鹽緩沖液提取法

磷酸鹽緩沖液提取法依照國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測》(GB／T 5009.199—2003)進(jìn)行。

1、葉菜類的磷酸鹽緩沖液提取法：取去除泥土的待測樣品(白菜、甘藍(lán)、油菜、韭菜等)剪成1cm2的小塊(韭菜剪成1cm長的小段)，隨機(jī)取小塊或小段樣品1g，放入,燒杯或提取瓶中，加入5mL提取緩沖液(15.0g Na2HPO4·12H2O和1.59g NaH2P04溶于500 mL蒸餾水，pH 7.5)，振蕩l～2 min。倒出提取液，靜置3～5 min，用于丁酰膽堿酯酶分光光度法測定?；螂S機(jī)取小塊或小段樣品約5g，放入提取瓶中，加10mL緩沖液，振搖50次，靜置2 min以上，用速測卡法測定。

2、果菜及水果類的磷酸鹽緩沖液提取法：取待測樣品(番茄、黃瓜、青椒、茄子、蘋果、梨等)去除表面泥土，用取樣器沿果菜表面處取約1cm厚的樣品放人提取瓶中，加入提取緩沖液振蕩l～2min。倒出提取液，靜置3～5min后待測。對蘿卜等根菜類樣品，先去除表面泥土和須根，再按果菜類樣品提取方法提取。

(二)有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法依照國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗(yàn)方法酶抑制法》(GB／T 18630一2002)進(jìn)行。

擦去蔬菜表面的泥水，將可食部分剪碎，取2g置10mL提取瓶中，加5mL丙酮浸泡5min，不斷振搖，加0.2g碳酸鈣(對番茄等酸性較強(qiáng)的樣品可加0.3～O.4g)。如顏色較深，可加0.2g活性炭，搖勻，過濾。取1mL丙酮濾液于5mL燒杯中，吹干丙酮后加0.6mL 1/15m01/L pH 7.7的磷酸鹽緩沖液溶解，加入0.2mL 0.5％(m／V)次氯酸鈣水溶液搖勻，放置10 min進(jìn)行氧化處理，再加入0.6mL 10％(m/V)亞硝酸鈉水溶液搖勻，還原過量的氧化劑，處理液待測。

許多蔬菜(如蔥、蒜、韭菜、芹菜、番茄、蘿卜、茭白、蘑菇等)含有對酶活性有影響的次生代謝產(chǎn)物，容易使測定結(jié)果產(chǎn)生假陽性。葉綠素等色素也可能影響顯色反應(yīng)結(jié)果。處理這些樣品時，可采取整體(株)蔬菜浸提或采用表面測定法。在制樣中將樣品切成1～2cm的小塊，在確保農(nóng)藥提取效果的同時控制浸提時間，以減少色素等干擾物質(zhì)的溶出。如樣品浸提液出現(xiàn)渾濁，應(yīng)適當(dāng)增加樣品的靜置時間。

七、酶活性抑制分析的檢測方法

(一)分光光度法

1、乙酰膽堿酯酶活性抑制分析的分光光度法:乙酰膽堿酯酶活性抑制法的分光光度法采用國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗(yàn)方法-酶抑制法》(GB／T 18630 2002)。在上述有機(jī)溶劑(或磷酸鹽緩沖液)提取并經(jīng)氧化處理的溶液中，加入經(jīng)色譜柱純化的酶液O.2mL，搖勻后放置10min。加入2％(m／V)碘化硫代乙酰膽堿溶液0.2mL和O.04％(m／V)的2，6-二氯靛酚水溶液0.1mL混勻，37℃下反應(yīng)5min，測吸光值A(chǔ)600(0D600)，A600越大，表明農(nóng)藥殘留量越高。A600＜0.7為未檢出，A600為O.7～0.9為可能檢出但殘留量較低，A600＞0.9為檢出。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析