三、酶源的選擇與酶的制備

酶的種類、酶的特異性、酶的活性和穩(wěn)定性等是影響酶活性抑制法測定農(nóng)藥殘留的靈敏度和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。常用的膽堿酯酶有乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶(butylcholineesterase，BchE)。乙酰膽堿酯酶又稱為真性或特異性膽堿酯酶，主要分布于動物的腦、脊髓和肌肉等組織中。丁酰膽堿酯酶又稱為非特異性或擬膽堿酯酶，主要分布于動物的血清和肝臟中。乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶催化膽堿酯類底物水解的速率不同，對底物的種類具有不同程度的選擇性。此外，植物中存在比較復(fù)雜的酯酶同工酶，其來源豐富、容易制備、成本低廉、保存方便，20世紀(jì)80年代開始被開發(fā)利用。植物源酯酶也屬于非特異性酯酶，酶的活性通常不如動物源酯酶高。酶活性抑制法常用的是昆蟲腦酯酶和血清酯酶，植物酯酶和肝臟酯酶應(yīng)用較少。不同來源酯酶的主要特性見表6-l和表6-2。

酶活性抑制法常用酶源及酶的制備和保存方法如下。

(一)昆蟲膽堿酯酶的制備

昆蟲體內(nèi)僅含有乙酰膽堿酯酶，主要分布在頭部，其次為胸部。由于家蠅等昆蟲的生活史短，可人工繁殖和飼養(yǎng)，故多以家蠅等昆蟲為酶源。昆蟲乙酰膽堿酯酶的提取方法(梁同庭，1990)：取敏感家蠅或蜜蜂，在-20℃冷凍致死后裝入塑料袋中，加入少許干冰振搖，硬化家蠅或蜜蜂的頭部，使之與胸部斷裂分開，收集頭部，按0.24g/mL的量在pH7.5、0.1mol/L磷酸緩沖液中勻漿30s，勻漿液在4℃下以3500r/min離心5min。取上清液經(jīng)雙層紗布過濾，濾液經(jīng)雙層濾紙在布氏漏斗上抽濾，將濾液按每管1mL分裝，使用時以pH 7.5的0.02mol/L磷酸緩沖液稀釋15倍。該酶液密封后于-20℃冰箱中保存3個月后未見酶活力下降。若將提取的酶液冷凍干燥，制成酶凍干粉，可以保存更長的時間，便于運輸。

(二)動物血清酯酶的制備

動物血清中乙酰膽堿酯酶含量較高，來源比較廣泛，如牛血清、馬血清和雞鴨等禽類動物血清等。將新鮮抽取的動物血清注入無抗凝劑的試管(15～25mL)中，封口后在37℃恒溫箱內(nèi)放置3h，使血細(xì)胞凝固，淡黃色血清慢慢滲出。用吸管將血清吸入離心管中，于4℃下以3000r/min離心5～10min，取上清液分裝后在-20℃冷凍保存，使用時以蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)。

(三)動物肝臟酯酶的制備

取動物(牛、豬、兔、鼠、雞等)新鮮肝臟，去筋、膜、脂肪后切碎，按1份肝臟加3份蒸餾水(m／V)后勻漿，勻漿液在4℃下以2000～3000 r/min離心15～30min，上清液分裝后在-20℃下儲存?zhèn)溆?，使用時以蒸餾水稀釋5～20倍。實踐表明，豬肝中提取的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的敏感性較強(qiáng)。

(四)植物源酯酶的制備

谷物是酯酶含量較高的酶源，小麥中酯酶活性比玉米、大米和小米高。提取方法：取新鮮食用小麥面粉置于具塞三角瓶中，按1∶5(m/m)比例加入蒸餾水，在振蕩器上振蕩30 min，于4℃下以5000r/min離心20min，上清液置4℃冰箱中保存，使用時加蒸餾水稀釋。實踐表明，植物酯酶活性抑制法測定農(nóng)藥的精確度和靈敏度不如動物膽堿酯酶活性抑制法好。

四、酶的純化與保存

酶活性抑制法檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，多采用乙酰膽堿酯酶的粗提液。酶的粗提液可采用處理過的羧甲基纖維素柱色譜凈化[依照國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗方法酶抑制法》(GB/T 18630--2002)]。取10g羧甲基纖維素加100mL 0.5m01/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液混勻，浸泡15min后用布氏漏斗抽濾。水洗濾餅至中性后懸浮于100mL 1mol/L HCl-0.5mol/L NaCl溶液中混勻，靜置15min，用布氏漏斗抽濾。水洗濾餅至中性后將濾餅懸浮于0.005 mol/L pH6.0的磷酸緩沖液中。將處理好的羧甲基纖維素懸浮液加入色譜柱，加入膽堿酯酶粗提液。在梯度混合器的初始液瓶中加150 mL 0.005 mol/L pH6.0的磷酸緩沖液，在梯度混合器的高濃度液瓶中加150 mL0.1 m01/L pH6.0的磷酸緩沖液，連接色譜柱，以2mL/min流速做梯度洗脫，收集后1/2流出液。

提取或凈化后的酶液如果在一周內(nèi)使用完畢，可在0～5℃下保存。多數(shù)情況下采用分裝密封后200C冰箱中保存，保存時間最好不超過3個月。酶液反復(fù)凍融會顯著降低酶的活性，所以酶液的凍融一般不能超過2次。如將酶液冷凍干燥，制成酶的凍干粉，4℃保存的有效期可達(dá)1年。

五、底物和顯色劑

酶活性抑制法的顯色反應(yīng)可使用的酶的底物和顯色劑很多，如乙酰膽堿(ACh)、乙酸萘酯、乙酸羥基吲哚及其衍生物等均可作為酶的底物，根據(jù)所使用的酶的底物和顯色機(jī)理的不同，顯色反應(yīng)大致可分為以下幾種類型。

(一)乙酰膽堿一溴百里酚藍(lán)顯色法

溴百里酚藍(lán)為pH指示劑，利用底物水解液酸堿性變化，通過pH指示劑顯色。

溴百里酚藍(lán)變色范圍pH 6.2(黃色)→7.6(藍(lán)色)，在薄層色譜一酶抑制法中，板上含有農(nóng)藥的部位酶活性受抑制，不能水解生成乙酸，呈藍(lán)色斑點；板上不含農(nóng)藥部位因為有乙酸產(chǎn)生，pH≤6.2，呈現(xiàn)黃色。

參考資料：農(nóng)藥殘留分析