目的 研究補(bǔ)骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的化學(xué)成分。方法 利用硅膠柱色譜，MCI柱色譜，ODS柱色譜以及高效液相色譜等分離手段，對(duì)補(bǔ)骨脂的95%乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，并通過(guò)質(zhì)譜和核磁共振等波譜數(shù)據(jù)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果 從補(bǔ)骨脂的95%乙醇提取物中分離鑒定10個(gè)化合物，它們分別是seputhecarpanA（1）、補(bǔ)骨脂酚（2）、13-羥基異補(bǔ)骨脂酚（3）、12-羥基異補(bǔ)骨脂酚（4）、二聚補(bǔ)骨脂酚A（5）、二聚補(bǔ)骨脂酚B（6）、二聚補(bǔ)骨脂酚C（7）、4,2′-二羥基-4′-甲氧基-5′-（3′′,3′′-二甲基烯丙基）-查爾酮（8）、isobavachromene（9）、4-hydroxyisolonchocarpin（10）。結(jié)論 其中化合物1首次從該植物中分離得到。通過(guò)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)酶抑制活性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了化合物的活性，結(jié)果顯示化合物2和7具有PTP1B酶的抑制活性。

補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）又名：破故紙、婆固脂等，是豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，主要產(chǎn)于云南西雙版納和四川金沙江流域，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、溫脾止瀉、納氣平喘的功效，臨床用于白癜風(fēng)和骨質(zhì)疏松等疾病的治療。補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分是單萜酚、單萜酚二聚體、單萜酚與黃酮，查爾酮、香豆素和異黃酮的異二聚體、黃酮、香豆素和脂肪酸等。補(bǔ)骨脂提取物及從中分離得到的單體化合物具有多種藥理活性，包括雌激素活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性、抗菌活性、抗炎活性、抗抑郁活性、肝保護(hù)活性、成骨細(xì)胞活性和抗糖尿病作用等，具有很好的藥用價(jià)值。近年來(lái)在抗糖尿病的研究中，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B酶）可以調(diào)節(jié)許多與糖尿病重要靶點(diǎn)相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答，對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，是抗糖尿病研究的熱點(diǎn)之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多種天然酚類成分對(duì)PTP1B酶有良好的抑制活性，因此本研究對(duì)補(bǔ)骨脂的酚類成分展開研究，并通過(guò)PTP1B酶的抑制活性篩選活性化合物，為補(bǔ)骨脂的抗糖尿病研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。利用多種色譜分離手段從補(bǔ)骨脂的95%乙醇提取物中得到了10個(gè)酚類化合物（圖1），其中化合物1為首次從該植物中分離得到。并對(duì)化合物進(jìn)行了體外PTP1B酶的抑制活性測(cè)試，結(jié)果顯示，化合物2和7表現(xiàn)出PTP1B酶抑制作用。

1 儀器與材料

核磁共振光譜（NMR）是在BrukerAV-ш400、BrukerAV-ш500、VNS-600、Bruker AV-600光譜儀上，以TMS作為內(nèi)標(biāo)，在氘代氯仿（CDCl3）中運(yùn)行的。高分辨質(zhì)譜（HRESIMS）數(shù)據(jù)記錄在Agilent 1100系列LC/MSD離子阱質(zhì)譜儀上。將Agilent 1100與ODS-C18色譜柱（YMC）或苯基柱（YMC-Pack Ph）結(jié)合使用進(jìn)行HPLC分析實(shí)驗(yàn)。使用帶有兩個(gè)泵（C-605），紫外線檢測(cè)器（C-635）和ODS色譜柱（60×600 mm，50 μm，400 g；YMC）的Büchi系統(tǒng)進(jìn)行MPLC實(shí)驗(yàn)。在具有UV檢測(cè)器（SPD-16）和ODS-C18色譜柱（YMC）或苯基柱（YMC-Pack Ph）的Shimadzu LC-16P儀器上進(jìn)行制備型HPLC分離實(shí)驗(yàn)。硅膠（100-200目，200-300目，青島青島海洋化學(xué)有限公司），ODS（50 μm，YMC，日本）和MCI（CHP 20/P 120，日本）用于柱色譜。此外，TLC實(shí)驗(yàn)是在預(yù)涂硅膠GF254板上結(jié)合紫外線進(jìn)行的。

補(bǔ)骨脂于2018年8月從中國(guó)河北省安國(guó)市購(gòu)買。由馬林教授（IMM，CAMS）鑒定為補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.），標(biāo)本（ID-201846）存放在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所（IMM）的植物標(biāo)本室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

補(bǔ)骨脂（10kg）用95％乙醇室溫浸提（每次60L，浸泡1周），浸提2次。合并浸提液，過(guò)濾，回收乙醇得1350g提取物。乙醇提取物與硅膠拌樣，通過(guò)硅膠柱色譜分離。用石油醚，石油醚/乙酸乙酯（20：1-2：1），乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇（4：1-1：1）和甲醇進(jìn)行洗脫，得到132個(gè)洗脫部分（A1-A132）。將流分A32-A53合并約60g，與MCI拌樣，進(jìn)行MCI柱色譜分離，用50%至100%的甲醇梯度洗脫，得到20個(gè)洗脫部分（B1-B20）。將流分B5-B9合并約7.8g，進(jìn)行中壓液相色譜分離，用75%至100%的甲醇梯度洗脫，得到40個(gè)洗脫部分：C1-C40。流分C7通過(guò)反相液相色譜（47%的乙腈水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物3（5mg）和化合物4（5mg）。流分C9通過(guò)反相液相色譜（55%的乙腈水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物1（5mg）。流分C14通過(guò)反相液相色譜（73%的甲醇水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物10（4mg）。流分C21通過(guò)反相液相色譜（苯基柱，70%的甲醇水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物9（7mg）。流分C26通過(guò)反相液相色譜（苯基柱，70%的甲醇水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物2（5mg）和化合物8（6mg）。組分B13-B14合并約11.2g，用80%~95%的甲醇水溶液進(jìn)行中壓液相色譜的梯度洗脫，得到55個(gè)洗脫部分：D1-D55。流分D22-D23通過(guò)反相液相色譜（87%的乙腈水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物7（7mg）。流分D38-D39通過(guò)反相液相色譜（92%的甲醇水溶液洗脫）進(jìn)行純化，得到化合物5（6mg）和化合物6（6mg）。

2.2 PTP1B酶的抑制活性測(cè)試

在hGST-PTP1B-BL21大腸桿菌中過(guò)表達(dá)的人GST-PTP1B酶基因重組蛋白，并通過(guò)GST親和層析純化。試劑pNPP用作測(cè)量PTP1B酶的活性的底物。在室溫下將化合物，陽(yáng)性對(duì)照CC06240[20](10 μ)和酶預(yù)孵育5 min。在終體積為100 μL，含有50 mol/Lm HEPES，5 mol/LM DTT，150 mol/LM NaCl，2 mol/LM EDTA和2 mol/LM pNPP（pH 7.0）的活性系統(tǒng)中測(cè)量，在30 ℃孵育10 min，然后添加50 μL 3mol/L NaOH。然后，在405 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。沒有GST-PTP1B蛋白的類似系統(tǒng)用作空白，化合物的每種濃度在3個(gè)平行峰中進(jìn)行測(cè)試。使用Microsoft Excel軟件計(jì)算IC50值，陽(yáng)性對(duì)照的IC50值為0.77 μmol/L。

3 已知化合物1~10的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:黃色粉末，根據(jù)高分辨質(zhì)譜分子離子峰 m/z 323.1272 [M + H]+（計(jì)算值為323.1278）確定其分子式為C20H18O4。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 1.77 (3H, s, H-6′), 3.01 (1H, dd, J = 7.5, 15.0 Hz, Ha-3′), 3.31 (1H, dd, J = 9.5, 15.0 Hz, Hb-3′), 3.50 (1H, m, H-6a), 3.59 (1H, t, J = 10.5 Hz, Ha-6), 4.22 (1H, dd, J = 5.0, 10.5 Hz, Hb-6), 4.91 (1H, br s, Ha-5′), 5.08 (1H, br s, Hb-5′), 5.19 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′), 5.49 (1H, d, J = 6.5 Hz, Ha-11), 6.36 (1H, a, H-8), 6.36 (1H, a, H-4), 6.40 (1H, s, H-10), 7.07 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7), 7.27 (1H, s, H-1)。13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δC: 126.4 (C-1), 120.8 (C-2), 161.2 (C-3), 98.3 (C-4), 156.1(C-4a), 66.6 (C-6), 39.4 (C-6a), 119.5 (C-6b), 126.4 (C-7), 107.5 (C-8), 160.7 (C-9), 98.3 (C-10), 156.8 (C-10a), 79.2 (C-11a), 112.2 (C-11b), 86.7 (C-2′), 33.8 (C-3′), 143.7 (C-4′), 111.8 (C-5′), 17.1 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致，故鑒定化合物1為seputhecarpan A。

化合物2:黃色晶體，根據(jù)高分辨質(zhì)譜分子離子峰 m/z 257.1896 [M + H]+（計(jì)算值為257.1900）確定其分子式為C18H24O。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 1.19 (3H, s, H-16), 1.62 (3H, s, H-14), 1.67 (3H, s, H-15), 5.02 (2H, m, H-18), 5.88 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-17), 6.05 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8), 6.25 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-7), 6.76 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3和H-5), 7.24 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2和H-6)。13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δC: 130.8 (C-1), 127.3 (C-2), 115.3 (C-3), 154.7 (C-4), 115.3 (C-5), 127.3 (C-6), 126.4 (C-7), 135.7 (C-8), 42.5 (C-9), 41.3 (C-10), 23.2 (C-11), 124.8 (C-12), 131.3 (C-13), 17.6 (C-14), 25.7 (C-15), 23.3 (C-16), 145.9 (C-17), 111.9 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致，故鑒定化合物2為補(bǔ)骨脂酚。

化合物3:黃色油狀物，根據(jù)高分辨質(zhì)譜分子離子峰 m/z 295.1664 [M + Na]+（計(jì)算值為295.1669）確定其分子式為C18H24O2。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 1.16 (3H, s, H-16), 1.30 (3H, s, H-14), 1.30 (3H, s, H-15), 5.02 (2H, m, H-18), 5.88 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-17), 5.63 (2H, a, H-11, H-12), 6.05 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8), 6.24 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-7), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3和H-5), 7.23 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2和H-6)。13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δC: 130.5 (C-1), 127.4 (C-2), 115.4 (C-3), 154.9 (C-4), 115.4 (C-5), 127.4 (C-6), 126.8 (C-7), 135.2 (C-8), 42.6 (C-9), 43.9 (C-10), 123.1 (C-11), 141.0 (C-12), 70.9 (C-13), 29.9 (C-14), 29.9 (C-15), 23.5 (C-16), 145.5 (C-17), 112.2 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]對(duì)照一致，故鑒定化合物3為13-羥基異補(bǔ)骨脂酚。

化合物4:黃色油狀物，根據(jù)高分辨質(zhì)譜分子離子峰 m/z 273.1844 [M + H]+（計(jì)算值為273.1849）確定其分子式為C18H24O2。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 1.19 (3H, s, H-16), 1.70 (3H, s, H-14), 4.04 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-12), 4.84 (1H, s, H-15), 4.94 (1H, s, H-15), 5.03 (2H, m, H-18), 5.86 (1H, dd, J = 10.5, 17.5 Hz, H-17), 6.03 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8), 6.25 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-7), 6.77 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3和H-5), 7.24 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2和H-6)。13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δC: 130.6 (C-1), 127.4 (C-2), 115.4 (C-3), 154.8 (C-4), 115.4 (C-5), 127.4 (C-6), 126.7 (C-7), 135.5 (C-8), 42.1 (C-9), 36.8 (C-10), 29.6 (C-11), 76.5 (C-12), 147.3 (C-13), 17.5 (C-14), 111.4 (C-15), 23.4 (C-16), 145.7 (C-17), 112.1 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致，故鑒定化合物4為12-羥基異補(bǔ)骨脂酚。

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