2.1.2 色譜柱的考察

由于葉綠素a和葉綠素b的檢測波長相近，為清楚考察色譜柱效果，選用波長445 nm檢測葉黃素，645 nm檢測葉綠素a和葉綠素b。選用商品化的C18-AQ柱和氰基柱分別對待測樣品進(jìn)行分析，檢測結(jié)果表明，在氰基柱上分離3種色素的保留時(shí)間較長，分離度較高，如圖1所示，有利于葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的定量檢測。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限

分別配制濃度為1.2.1所述的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣后以不同濃度的峰面積（平均值/10000）y為縱坐標(biāo)，配制的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，建立y-x標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果如表1所示，根據(jù)信噪比S/N=3，測得各組分定量限和檢出限結(jié)果見表1。3種色素均在0.05～50 mg/L范圍內(nèi)線性極佳（R2=0.9999）。

2.2.2 方法精密度

取3種色素的混合標(biāo)準(zhǔn)品，在相同條件下重復(fù)進(jìn)樣測定6次。分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），如表2所示。3種植物色素的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于1%，表明方法的精密度良好。

2.2.3 方法穩(wěn)定性

取同批綠葉碎片平行稱取3份，按1.2.2方法對樣品進(jìn)行處理，于制樣后的2、6、10 h分別進(jìn)樣分析測定3種色素的含量，測定日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d每天重復(fù)檢測試樣，測定日間精密度，結(jié)果示于表3。結(jié)果表明，試樣的日內(nèi)及日間精密度均低于5%，表明該方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。

2.2.4 回收率及精密度

對3份相近濃度的試樣精密量取900 μL，分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份樣品重復(fù)分析3次。采用外標(biāo)法計(jì)算平均回收率及精密度，結(jié)果表明，葉黃素、葉綠素a和葉綠素b的加標(biāo)平均回收率均在90%～110%之間，RSD <5%，滿足定量分析要求。

2.3 樣品測定

按1.2.2方法制備綠色植物葉片以及葉片根部樣品溶液各3份，分別按1.2.3方法重復(fù)分析3次，通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算植物葉片以及葉片根部樣品中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素的含量。圖2為實(shí)際植物葉片樣品的色譜圖（不同檢測波長下），其中3種植物色素與其標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間可以很好地吻合。計(jì)算結(jié)果表明，按所建立的方法檢測的植物葉片中葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的含量分別為0.229、0.714、0.821 mg/g；檢測的植物葉片根部葉綠素a、葉綠素b和葉黃素的含量分別為0.058、0.089、0.146 mg/g。

3 結(jié)論

針對目前植物色素分析時(shí)間長，流動(dòng)相體系較為復(fù)雜，且待測組分難以達(dá)到基線分離的現(xiàn)狀下，建立了準(zhǔn)確測定植物葉片以及葉片根部中葉綠素a、葉綠素b以及葉黃素含量的反相高效液相色譜方法，可對植物體中重要的3種色素進(jìn)行準(zhǔn)確快速的分析。方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性以及平均加標(biāo)回收率等各項(xiàng)方法學(xué)參數(shù)均表明，該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均符合實(shí)際樣品檢測過程中的要求。本研究方法的建立為植物中重要色素的定量提供了可靠、快速、準(zhǔn)確的高通量分析方法。

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