β-甘露聚糖酶是一類能夠水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖為主鏈的內(nèi)切水解酶的總稱，屬于半纖維素酶類，廣泛存在于自然界。微生物是工業(yè)生產(chǎn)甘露聚糖酶的主要來(lái)源，真菌和細(xì)菌都是產(chǎn)生甘露聚糖酶的主要微生物，其中細(xì)菌是產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最大群體。甘露聚糖酶有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，在食品加工、造紙、畜牧業(yè)、石油開(kāi)采及其它領(lǐng)域都有光明的應(yīng)用前景。近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，甘露聚糖酶作為第三代飼料酶成為了研究的熱點(diǎn)。

在飼料中添加β-甘露聚糖酶可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝和營(yíng)養(yǎng)消耗，提高飼料轉(zhuǎn)化率；改善腸道微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力；促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，加快生長(zhǎng)速度；提升低質(zhì)量飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。然而一般β-甘露聚糖酶的耐酸性較差，難以在動(dòng)物腸胃環(huán)境下發(fā)揮作用，因此尋找具有耐酸性的β-甘露聚糖酶是關(guān)鍵所在。

本實(shí)驗(yàn)以耐酸性作為篩選指標(biāo)，從魔芋種植土壤中篩選得到耐酸性的β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生菌，對(duì)該菌的發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1、材料

（1）樣品來(lái)源

土壤樣品采集自重慶市奉節(jié)縣黃國(guó)軍魔芋種植場(chǎng)。

（2）培養(yǎng)基(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))

富集培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%、魔芋粉1.5%、NaC10.5%、蛋白胨0.3%、pH7.2～7.4，115℃滅菌30min。

篩選培養(yǎng)基：NH4C10.5%、NaC10.5%、甘露聚糖1.0%、瓊脂2.0%、pH7.2～7.4，115℃滅菌30min。

種子培養(yǎng)基：魔芋粉1.0%、蛋白胨0.5%、NaCl1.0%、自然pH，115℃滅菌30min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉2.0%、蛋白胨1.0%、NaCI1.0%、自然pH，115℃滅菌30min。

2、菌株篩選

土壤預(yù)處理后進(jìn)行富集培養(yǎng)，用梯度稀釋法處理富集培養(yǎng)液并涂布在篩選培養(yǎng)基上，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且菌落直徑大的單菌落進(jìn)行劃線分離，純化三次以上，斜面4℃保存。

將分離純化得到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵后離心得到粗酶液。粗酶液用pH4、0.2mo/L磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液37℃、150r/min耐酸處理1h，后用DNS法測(cè)定粗酶液酶活，選擇酶活力最大的菌株為供試菌。

3、酶活力測(cè)定

取粗酶液0.1mL，加至0.9mL槐豆膠溶液(0.5g槐豆膠+100mL、pH6.0、0.2mol/L磷酸緩沖液)試管中，55℃的水浴反應(yīng)10min。在試管中加入lmLDNS試劑，沸水浴5min滅活和顯色，后流水冷卻，定容至10mL。以空白液調(diào)零，在540nm處測(cè)其吸光度。在甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(參考張聞的方法制得)上查得相應(yīng)的甘露糖含量，計(jì)算甘露聚糖酶酶活。

酶活力定義：1個(gè)酶活力單位(U)為以pH6.0、0.5%槐豆膠為底物，在55℃水浴中反應(yīng)10min，每1lmin產(chǎn)生相當(dāng)于lumolD-甘露糖所需要的酶的量。

式中：Fg-由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的甘露糖微克數(shù)、n-稀釋倍數(shù)、0.1-酶液毫升數(shù)、t-恒溫時(shí)間、180-甘露糖分子量。

4、菌株鑒定

將篩選得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～12h，離心收集菌體。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司)提取細(xì)菌總基因組DNA。采用16SrDNA擴(kuò)增通用引物：

7F：CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA、27F：AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增該菌株的16SrDNA。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA(20～50ng/uL)0.5μL、10xBuffer(withMg2+)2.5L、dNTP(2.5mmol)1μL、酶0.2μL、F(10umol)0.5μL、R(10umol)0.5μL、加雙蒸餾水至25μL。PCR循環(huán)條件：預(yù)變性：94C4min，變性：94℃45sec，退火：55℃45sec，延伸(30cycle)：72℃1min，修復(fù)延伸：72℃10min，終止反應(yīng)：4℃。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程股份有限公司)回收PCR產(chǎn)物。將PCR得到的16SrDNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果后進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，BLAST對(duì)比分析GenBank中現(xiàn)有的細(xì)菌16SrDNA，并使用MEGAX構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行同源性分析。

5、響應(yīng)面BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。選取自變量因素為A-魔芋粉、B-酵母浸粉、C-Mn22+，響應(yīng)值(R1)為酶活。使用軟件Design-Expert10.0.7對(duì)上述因素進(jìn)行響應(yīng)曲面回歸分析，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。BOX-Behnken試驗(yàn)因素水平表如表1：

二、結(jié)果與分析

1、菌株的分離與篩選

將富集培養(yǎng)液的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基，產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株會(huì)在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以此來(lái)篩選菌株。挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且菌落直徑大的10株單菌落進(jìn)入復(fù)篩，并命名為NSG-1、NSG-2、……、NSG-10。

將篩選得到的10株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用DNS法測(cè)定粗酶液酶活力。

NSG-6在經(jīng)耐酸性實(shí)驗(yàn)后酶活力為1.78U/mL相對(duì)最高，其正常酶活力為2.05U/mL，故將其作為供試菌株。

加雙蒸餾水至25μL。PCR循環(huán)條件：預(yù)變性：94℃4min，變性：94℃45sec，退火：55℃45sec，延伸(30cycle)：72℃1min，修復(fù)延伸：72℃10min，終止反應(yīng)：4℃。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程股份有限公司)回收PCR產(chǎn)物。將PCR得到的16SrDNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果后進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，BLAST對(duì)比分析GenBank中現(xiàn)有的細(xì)菌16SrDNA，并使用MEGAX構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行同源性分析。

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