5、響應(yīng)面BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。選取自變量因素為A-魔芋粉、B-酵母浸粉、C-Mn2²⁺，響應(yīng)值(R1)為酶活。使用軟件Design-Expert10.0.7對(duì)上述因素進(jìn)行響應(yīng)曲面回歸分析，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。BOX-Behnken試驗(yàn)因素水平表如表1:

二、結(jié)果與分析

1、菌株的分離與篩選

將富集培養(yǎng)液的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基，產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株會(huì)在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以此來(lái)篩選菌株。挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且菌落直徑大的10株單菌落進(jìn)入復(fù)篩，并命名為NSG-1、NSG-2、....NSG-10。

將篩選得到的10株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，用DNS法測(cè)定粗酶液酶活力。結(jié)果如圖1所示，NSG-6在經(jīng)耐酸性實(shí)驗(yàn)后酶活力為1.78U/mL相對(duì)最高，其正常酶活力為2.05U/mL，故將其作為供試菌株。

2、菌株鑒定

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果即Marker組成見(jiàn)圖2。Marker中3000bp、1000bp和500bp條帶濃度為60ng/3μL顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30ng/3μL，電泳方向從上向下。從電泳結(jié)果可知:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，且分子量在1400bp左右與16SrDNA片段相符，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

測(cè)序結(jié)果如圖3所示，NSG-6的16SrDNA序列共1473bp。將該序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST，然后用軟件MEGAX對(duì)16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，部分結(jié)果見(jiàn)表2。采用鄰近連接法構(gòu)建NSG-6與有關(guān)細(xì)菌16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(相似的重復(fù)計(jì)算1000次)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由同源性比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，NSG-6與EnterobacterludwigiiEN-119(NR042349.1)相似性達(dá)到100%，判斷其為路德維希腸桿菌。

3、響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

（1）響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下，培養(yǎng)基組成:魔芋粉2.5%、酵母浸粉2.5%、MnSO₄0.5%；發(fā)酵條件:自然pH、接種量2.00%、發(fā)酵溫度35℃、搖床轉(zhuǎn)速230r/min。

運(yùn)用軟件Design-Expert10.0.7對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。再對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得多元線(xiàn)性回歸模型:

R1=4.85+0.84A+0.20B-0.26C+0.11AB-0.25AC+0.27BC+0.35A₂-0.24B₂-0.63C₂R₂=0.9958

其中R1是預(yù)測(cè)的甘露聚糖酶的酶活，A是魔芋粉添加量，B是酵母浸粉添加量，C是硫酸錳添加量。

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