2.3 總氮配方中添加磷酸甜菜堿對賴氨酸發(fā)酵的影響

以發(fā)酵運行中總氮起始添加時間(A)、磷酸甜菜堿在總氮中添加質(zhì)量濃度(B)、糖與氮的體積比(C)為3個考查因素，以賴氨酸轉(zhuǎn)化率為因變量，采用SPSS軟件設(shè)計三因素五水平正交實驗，實驗結(jié)果如表5所示，SPSS軟件對實驗結(jié)果表5進(jìn)行分析，其結(jié)果如表6所示。

從表6中可以看出：該模型p=0.001<0.01，說明模型極顯著，R²=0.886，R²越接近1，說明模型擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。Ⅲ平方和比較B>A>C，說明3個因素對轉(zhuǎn)化率影響大小依次為B，A，C。總氮中磷酸甜菜堿添加質(zhì)量濃度(B)對賴氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率影響極其顯著(F=12.934，p=0<0.01)；起始流加時間(A)對賴氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率影響極其顯著(F=7.94，p=0.002<0.01)；糖氮體積比(C)對賴氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率影響最小，不顯著(F=2.445，p=0.103>0.05)。

采用SPSS軟件對表5實驗數(shù)據(jù)方差分析，得出主因素A，B對賴氨酸轉(zhuǎn)化率影響的95%置信區(qū)間，其結(jié)果如表7，8所示。

由表7得出：總氮中磷酸甜菜堿添加質(zhì)量濃度(B)為8 g/L時糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高水平，置信區(qū)間最高(71.253%～71.319%)，為最佳添加質(zhì)量濃度；質(zhì)量濃度低于4 g/L或高于12 g/L時糖酸轉(zhuǎn)化水平明顯下降。由表8得出：總氮起始流加時間(A)為5～7 h時，賴氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高，置信區(qū)間最高(71.239%～71.305%)，當(dāng)9 h開始流加后，糖酸轉(zhuǎn)化率下降明顯。

3 討 論

三級種子活力、發(fā)酵罐OD峰值都影響著發(fā)酵罐指標(biāo)，通過以往生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析：當(dāng)三級種子成熟周期大于9 h時，發(fā)酵罐OD峰值提前、耗糖速率下降，單產(chǎn)及轉(zhuǎn)化率等生產(chǎn)指標(biāo)下降明顯，對生產(chǎn)極為不利。分析原因在于三級種子培養(yǎng)后期菌體密度增大，而通風(fēng)、攪拌功率和罐壓都提高到了極限，造成種子長期缺氧，在逆生長環(huán)境下用于生產(chǎn)的基因工程菌為了適應(yīng)生存，菌體內(nèi)過表達(dá)的產(chǎn)酸促進(jìn)基因片段會大量丟失，造成菌體增殖活性增加而產(chǎn)酸能力下降，最終導(dǎo)致發(fā)酵指標(biāo)顯著下降。添加一定量磷酸甜菜堿起到了以下3個重要作用：

1) 維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓。當(dāng)外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時，細(xì)胞吸收或合成的甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、提高鉀鈉泵功能、阻止胞內(nèi)水分丟失等方式增加細(xì)胞對滲透壓的抗性。

2) 參與甲基化反應(yīng)。甲基參與DNA甲基化反應(yīng)，生產(chǎn)菌的遺傳物質(zhì)DNA經(jīng)過甲基化修飾，其遺傳及表達(dá)穩(wěn)定性提高，有利于賴氨酸發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)酸能力的保持。而甜菜堿分子中含有3個甲基，DNA甲基化修飾提供了甲基供體。在甲基化反應(yīng)中，甜菜堿-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化甜菜堿向高半胱氨酸轉(zhuǎn)移一個甲基，分別生成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸，后者為VB12的合成提供甲基。而甲硫氨酸、VB12都有利于賴氨酸生產(chǎn)菌生長繁殖。

3) 磷酸甜菜堿中的磷酸根離子提高培養(yǎng)基中的溶磷，溶磷是限制菌體生長的主要因素，它參與菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜構(gòu)成，同時磷參與葡萄糖磷酸化分解以及ATP，AMP和AGP等能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。因此磷酸甜菜堿替代氯化膽堿后，三級種子成熟周期、發(fā)酵罐OD峰值周期都明顯縮短。

三級種子及發(fā)酵罐底料中添加磷酸甜菜堿后將三級種子成熟周期縮短1.5 h， 發(fā)酵罐OD由對照組均值0.727提高到0.875，發(fā)酵產(chǎn)酸較對照組提高10 g/L，轉(zhuǎn)化率也有一定提升但不顯著。原因分析有兩點：

1) 在于賴氨酸發(fā)酵過程有中間放料，隨著中間放料菌體及底料營養(yǎng)大量流失，造成OD峰值回降迅速，最終影響產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率。工業(yè)化生產(chǎn)上通過在賴氨酸發(fā)酵過程中流加總氮的方式補充營養(yǎng)，維持菌體中后期活性。

2) 菌體內(nèi)合成的賴氨酸需要通過細(xì)胞膜賴氨酸外排泵排出胞外，在發(fā)酵中后期發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度高與胞內(nèi)質(zhì)量濃度，造成細(xì)胞滲透壓增高。通過總氮添加一定量的磷酸甜菜堿，當(dāng)發(fā)酵中后期外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時，細(xì)胞吸收的甜菜堿發(fā)揮其維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的特性，能夠通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、提高鉀鈉泵功能、阻止胞內(nèi)水分丟失等方式增加細(xì)胞對滲透壓的抗性。從而降低了發(fā)酵中后期破胞、提高了賴氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換率。

4 結(jié) 論

現(xiàn)常用的發(fā)酵促進(jìn)劑有氯化膽堿、甜菜堿鹽酸鹽和蛋氨酸等，其中前兩者含有大量氯離子不能被菌體利用，導(dǎo)致大量氯離子殘存于發(fā)酵液中，對發(fā)酵罐及后提取設(shè)備造成很大腐蝕，嚴(yán)重影響設(shè)備使用壽命，而且經(jīng)常引起設(shè)備微漏造成發(fā)酵罐染菌。磷酸甜菜堿作為新型發(fā)酵促進(jìn)劑，其中的磷酸根離子可以直接被菌體利用，甜菜堿可以參加甲基化代謝和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，減少細(xì)胞破碎。研究表明：磷酸甜菜堿替代等量氯化膽堿，可顯著提高三級種子生長速率、縮短成熟周期。賴氨酸發(fā)酵OD值、放罐酸與底料中磷酸甜菜堿添加量成正相關(guān)，發(fā)酵配方中磷酸甜菜堿添加量為添加0.5 g/L時轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)酸達(dá)到最優(yōu)?？偟辛姿崽鸩藟A最佳使用條件為：質(zhì)量濃度為8 g/L、添加時間為發(fā)酵罐運行5～7 h、糖氮體積比控制在20～28。研究結(jié)果對降低賴氨酸生產(chǎn)成本、降低氯離子對設(shè)備腐蝕有指導(dǎo)意義。

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