4標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取“2.2”項(xiàng)下各雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，制成內(nèi)標(biāo)均為10ng·mL^-1、SHH和MAP的質(zhì)量濃度均分別約為20，30，50，100，150和200ng·mL^-1(各相當(dāng)于限度濃度的20%，30%，50%，100%，150%和200%)的系列濃度梯度的溶液，按照“1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以待測(cè)物峰面積(Ax)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)比值R(Ax/Ai)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸。SHH和MAP濃度在20～200ng·mL^-1的范圍內(nèi)，峰面積比值和進(jìn)樣濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為R=0.0001223C-0.001020(r=0.9964)和R=0.005607C-0.01234(r=0.9998)。

5檢測(cè)限和定量限

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則9101中“響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法”計(jì)算，2個(gè)雜質(zhì)的檢測(cè)限約為10ng·mL^-1，定量限約為20ng·mL^-1。按照“2.2”項(xiàng)下方法，配制定量下限測(cè)試溶液6份，分別進(jìn)樣分析，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回算。SHH和MAP定量下限的測(cè)定濃度與理論濃度的偏差<20%，測(cè)定濃度的RSD(n=6)分別為13.4%和1.7%，符合測(cè)定的靈敏度和精密度要求。

6加樣回收率試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下配制2個(gè)待測(cè)物低、中、高濃度(2.5，5.0，7.5μg·mL^-1)和內(nèi)標(biāo)(500ng·mL^-1)的混合工作液，作為加樣回收率試驗(yàn)工作液。取已測(cè)定SHH和MAP基因毒性雜質(zhì)(含量均未檢出)的塞來(lái)昔布供試品約80mg，精密稱定，置于2mL離心管中，精密加入甲醇500μL，振搖使完全溶解，加入“2.1”項(xiàng)下二巰基蘇糖醇的醋酸銨緩沖液約20μL，搖勻；精密加入SHH和MAP的加樣回收率試驗(yàn)工作液20μL，搖勻，再加入純凈水約500μL，制得低(50%)、中(100%)、高(150%)濃度的加樣回收率試驗(yàn)溶液，每個(gè)濃度樣品平行制備3份；按照“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和雜質(zhì)對(duì)照溶液。按照“1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。按照內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算SHH和MAP的測(cè)得質(zhì)量濃度，并分別計(jì)算SHH和MAP的回收率，結(jié)果見表1。SHH與MAP的平均回收率分別為99.7%(RSD=6.0%，n=9)和97.6%(RSD=5.1%，n=9)，表明本法準(zhǔn)確度良好。

7精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下限度濃度雜質(zhì)對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算2個(gè)雜質(zhì)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD(n=6)分別為2.8%和1.7%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

8重復(fù)性試驗(yàn)

按照“6”項(xiàng)下方法制備“中濃度”的加樣供試液6份，按照“1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定，2個(gè)雜質(zhì)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD(n=6)分別為4.5%和2.0%，方法符合測(cè)定的精密度要求。

9穩(wěn)定性試驗(yàn)

9.1進(jìn)樣盤(4℃)穩(wěn)定性

按照“6”項(xiàng)下方法制備低、高濃度的加樣供試液和不加樣的低、高濃度的對(duì)照溶液。分別在0和4h，按照“1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。計(jì)算2個(gè)雜質(zhì)峰面積同內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD(n=6)，4組RSD均<10%，表明該處理?xiàng)l件下的4h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可滿足分析批測(cè)樣要求。

9.2雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液(-20℃)穩(wěn)定性

取“2”項(xiàng)下的方法將新鮮配制的各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液及-20℃冰箱儲(chǔ)存9d的各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別制成SHH和MAP為100ng·mL^-1，內(nèi)標(biāo)為10ng·mL^-1的混合對(duì)照溶液各3份，按照“1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。各對(duì)照品峰面積和稱樣量重量比值的RSD(n=6)均<10%，表明雜質(zhì)儲(chǔ)備液在-20℃條件下存放9d穩(wěn)定性良好。

10樣品測(cè)定

按照“2”項(xiàng)下方法分別配制雜質(zhì)對(duì)照溶液和供試品溶液，按照“1”項(xiàng)下的條件分別測(cè)定，記錄色譜圖。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積的比值計(jì)算供試品中SHH和MAP的含量，結(jié)果如圖2-C所示。3批待測(cè)樣本中SHH和MAP基因毒性雜質(zhì)均未檢出。

討論

在色譜柱選擇時(shí)，分別考察了ThermoBDSHypersilC18(100mm×4.6mm，2.4μm)、InsertsilODS-SP(250mm×4.6mm，5μm)、PhenomenexCuroSil-PFP(250mm×4.6mm，5μm)和WatersSymmetryC18(150mm×3.9mm，5μm)色譜柱。2個(gè)待測(cè)物在BDSHypersilC18色譜柱上均有較佳的峰型，且各峰分離度良好。在流動(dòng)相選擇時(shí)，分別考察甲醇、乙腈和甲醇-乙腈3種體系的流動(dòng)相，流動(dòng)相為乙腈時(shí)，各檢測(cè)通道無(wú)干擾；流動(dòng)相為甲醇時(shí)，檢測(cè)通道有較小干擾，但待測(cè)物的響應(yīng)較乙腈體系中增加約10倍。最終選用甲醇為流動(dòng)相的體系，以滿足樣品分析的靈敏度要求；同時(shí)在流動(dòng)相中添加一定量的甲酸，可增加待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)，加入適量乙酸銨能夠有效改善待測(cè)物的色譜峰型。

按照“6”項(xiàng)下條件，制備塞來(lái)昔布添加限度濃度對(duì)照溶液(未加穩(wěn)定劑)，SHH在連續(xù)6次進(jìn)樣分析中，峰面積的RSD(n=6)超過(guò)50%。參考文獻(xiàn)顯示苯肼類物質(zhì)多數(shù)使用衍生化方法測(cè)定，原因可能是苯肼類化合物在溶液中極易氧化降解，溶樣液(50%甲醇)測(cè)得其表觀pH顯酸性，苯肼類雜質(zhì)在酸性條件下更易發(fā)生氧化反應(yīng)。選擇抗氧化劑可以有效增加該類化合物的穩(wěn)定性，二巰基蘇糖醇是一類常用的抗氧化劑，當(dāng)pH在8～10之間時(shí)能發(fā)揮較好的抗氧化作用。最終優(yōu)化的條件為:溶解樣品的甲醇先用氨水堿化pH至8～9，各樣品在處理時(shí)加入適量5mmoL·L^-1二巰基蘇糖醇溶液(1%醋酸銨緩沖液)，保持溶液在堿性環(huán)境，使二巰基蘇糖醇發(fā)揮最大的抗氧化作用。經(jīng)測(cè)試加入抗氧化劑二巰基蘇糖醇和調(diào)節(jié)溶樣液pH后，苯肼雜質(zhì)的溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定，滿足分析批樣品測(cè)定的要求。

塞來(lái)昔布易溶于甲醇和乙腈，在甲醇中溶解度約為180mg，水中幾乎不溶。限度濃度供試品溶液中塞來(lái)昔布的濃度為80mg·mL^-1，80mg塞來(lái)昔布可完全溶解于1mL甲醇中，但是在甲醇和水的混合體系中不能完全溶解。在測(cè)定供試品中基因毒性雜質(zhì)時(shí)，首先應(yīng)選擇適宜的溶劑完全溶解供試品，使得潛在的基因毒性雜質(zhì)完全釋放、溶解，保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；同時(shí)考慮溶樣液和流動(dòng)相匹配的原則、高濃度的供試品會(huì)污染離子源或引起基質(zhì)效應(yīng)、液相分離時(shí)高濃度基質(zhì)易使色譜柱過(guò)載或析出等因素。綜合以上考慮，在供試品完全溶解的前提下，結(jié)合基質(zhì)鈍化法等方法，除去供試液中大部分的塞來(lái)昔布。

綜上所述，本研究采用LC-MS法測(cè)定塞來(lái)昔布中SHH和MAP2個(gè)苯肼類基因毒性雜質(zhì)，方法靈敏度高、專屬性好。采用特定的溶樣方式，去除高濃度塞來(lái)昔布樣品干擾；二巰基蘇糖醇的應(yīng)用解決了肼類雜質(zhì)水溶液不穩(wěn)定的問(wèn)題。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單方便，已成功應(yīng)用于塞來(lái)昔布中2個(gè)苯肼類基因毒性雜質(zhì)的分析檢測(cè)，為其質(zhì)量控制提供保障，同時(shí)也為藥物中微量肼類雜質(zhì)的檢測(cè)提供了新的方法。

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