目的：建立液相色譜-質譜(LC-MS)法測定塞來昔布中對肼基苯磺酰胺(SHH)和對甲苯腙基苯磺酰胺(MAP) 2個苯肼類基因毒性雜質。方法：采用Thermo BDS Hypersil C18(100 mm×4.6 mm，2.4μm)色譜柱，以0.1%甲酸銨-0.1%甲酸水溶液∶甲醇(90∶10)溶液為流動相A，以甲醇為流動相B進行線性梯度洗脫。樣品中加入5%二巰基蘇糖醇的醋酸銨緩沖液作為穩(wěn)定劑，在質譜電噴霧正離子化多反應監(jiān)測模式下，以內標法進行定量測定。結果：SHH和MAP在20～200 ng·mL^-1濃度范圍內線性關系良好；平均回收率分別為99.7%(RSD=6.0%，n=9)和97.6%(RSD=5.1%，n=9)。檢測限為10 ng·mL^-1，定量限為20 ng·mL^-1，對照溶液和供試品溶液于4℃進樣盤放置4 h內穩(wěn)定。結論：本實驗建立的LC-MS測定法適用于塞來昔布中SHH和MAP 2個苯肼類基因毒性雜質的檢測。

塞來昔布(celecoxib)化學名為4-[5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，特異性抑制環(huán)氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)，阻止炎性前列腺素類物質產生，臨床用于治療風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎等疾病。

基因毒性雜質(genotoxic impurity)是指可能具有遺傳毒性的一類物質。在研究藥物中基因毒性雜質時，應全面考慮藥物的合成工藝和純化流程等，充分考慮可能引入的基因毒性雜質。塞來昔布的合成工藝中，對肼基苯磺酰胺[(4-sulfamoylphenyl) hydrazine，SHH]是藥物合成的中間體；4，4，4-三氟-1-(4-甲苯基)-1，3-丁二酮與SHH反應生成塞來昔布，SHH還可能與反應中間體對甲基苯乙酮反應，生成對甲苯腙基苯磺酰胺[(4-methyl-acetophenone) para-sulfonamide phenylhydrazine，MAP]。因此，在塞來昔布合成工藝中，可能涉及SHH和MAP2個苯肼類雜質。肼是已知的基因毒性雜質，具有潛在致癌性，SHH和MAP屬于苯肼類基因毒性雜質，需對塞來昔布原料藥中這2個雜質進行限度檢查。

歐洲EMEA和美國FDA均提出采用“毒理學關注閾值”(threshold of toxicological concern，TTC)作為基因毒性雜質的可接受限度。2010年EMEA在基因毒性雜質限度計算方面指出，TTC值1.5μg·d^-1是應用在不同結構雜質的限度。結構相同或相似的基因毒性雜質，它們可能具有相同的作用模式或靶點，故該類雜質總量應不超過1.5μg·d^-1。SHH和MAP化學結構式如圖1所示，均為肼類基因毒性雜質，所以各雜質的限度均設置為0.75μg·d^-1。

關于肼類雜質的測定方法：徐秀蘭采用HPLC法測定塞來昔布中的SHH，限度為500 ng·m L^-1，靈敏度達不到本研究的要求；Vijaya等采用LC-MS法測定肼類雜質，條件探索時發(fā)現(xiàn)2個苯肼雜質在水溶液中極不穩(wěn)定；Raman等采用苯甲醛衍生化，LC-MS法測定肼類雜質；Oh等采用苯二甲醛衍生化及GC-MS法測定肼類雜質。衍生化結合LC-MS或GC-MS法的靈敏度均較高，但是操作繁瑣、涉及的試劑毒性較大。采用處理方法簡單、高靈敏高專屬的LC-MS法測定肼類雜質的報道較少。本研究建立塞來昔布中SHH和MAP 2個肼類雜質快速、便捷、高靈敏度的測定法，為肼類基因毒性雜質測定提供新的思路和方法，報道如下。

材料

1 儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(配有在線真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和Chromeleon工作站，美國Thermo Fisher Scientific公司)；TSQ Quantum Ultra(EMR)三重四極桿質譜儀(配有LC-quan 2.9QF1定量處理軟件，美國Thermo Fisher Scientific公司)；BDS Hypersil C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.4μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)；BS 21S分析天平(德國Satrious公司)；5424R臺式高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

2試藥和試劑

塞來昔布原料藥(南京億華藥業(yè)有限公司，批號：120701，120702，120703，純度：>99.0%)；SHH和MAP標準品(南京億華藥業(yè)有限公司，純度均為99.0%)；乙腈、甲醇(美國TEDIA公司，色譜純)；醋酸銨、甲酸、氨水(南京化學試劑有限公司，分析純)；二巰基蘇糖醇(上海麥克林生化科技有限公司，純度為99%)；卡馬西平對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100142-201004，純度為99.5%)；自制去離子水。

方法與結果
1 液相色譜-質譜條件

1.1 液相色譜條件

采用Thermo BDS Hypersil C18(100 mm×4.6 mm，2.4μm)色譜柱；以0.1%甲酸銨-0.1%甲酸水溶液∶甲醇(90∶10)為流動相A，甲醇為流動相B；線性梯度洗脫(A∶B)：0 min (60∶40)→1.5 min (60∶40)→2.0 min(15∶85)→5.5 min(15∶85)→5.6 min(60∶40)→7 min(60∶40)。柱溫為45℃，進樣量為10μL，流速為0.65 m L·min^-1，柱后分流(6∶4)進行LC-MS/MS測定。

1.2 質譜條件

電噴霧正離子化(ESI+)測定2個苯肼基因毒性雜質，質譜參數(shù)如下：噴霧電壓為4.5 k V，霧化溫度為200℃，毛細管溫度為350℃，輔助氣壓力為276 k Pa，鞘氣壓力為70 k Pa。三重四極桿質譜MRM模式檢測，SHH：m/z 170.9→m/z 90.1，碰撞能量為17 e V；MAP：m/z 304.1→m/z 209.1，碰撞能量為20 e V；內標：m/z 237.11→m/z 194.10，碰撞能量為25 e V。

2 溶液制備

2.1 二巰基蘇糖醇醋酸銨緩沖液

5 mmo L·L-1二巰基蘇糖醇的1%醋酸銨緩沖液，氨水調節(jié)p H至8～9。

2.2 雜質對照溶液

精密稱定SHH，MAP和內標卡馬西平各約10 mg，分別置于100 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 m L中各約含0.1 mg的雜質對照品儲備液。精密移取SHH和MAP對照品儲備液各約500μL、內標儲備液約50μL，置于同一10 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 m L中含SHH和MAP均約為5μg、內標為500 ng的混合工作溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。取甲醇500μL置于2 m L離心管中，加入二巰基蘇糖醇的醋酸銨緩沖液約20μL，精密移取雜質混合溶液20μL于離心管中，搖勻，再精密加入純凈水500μL，即得每1 m L中含SHH和MAP均約為100 ng，內標為10 ng的溶液，作為雜質對照溶液。

2.3 供試品溶液

精密稱定塞來昔布原料藥約80 mg，置于2 m L離心管中，加入甲醇(氨水堿化)500μL，振搖使溶解，加入二巰基蘇糖醇的醋酸銨緩沖液約20μL，搖勻；精密加入內標工作溶液(500ng·m L^-1) 20μL，搖勻，再加入純凈水約500μL，振搖，析出塞來昔布。15 800 r·min^-1低溫(4℃)離心10 min，取上清液，經0.22μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

3 專屬性試驗

在所建立的測定條件下，SHH和MAP 2個雜質的保留時間分別為1.76和4.66 min，2個待測物完全分離，峰形良好，LC-MS色譜圖見圖2?？梢娍瞻兹軇┖凸┰嚻啡芤簩y定無干擾。

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