①模擬的建立及其顯著性檢驗(yàn)對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次模擬回歸分析，得到三萜化合物得率（Y）對(duì)料液比（A）、回流時(shí)間（B）和溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=0.67＋6.000×10^-3A-8.525×10^-3B-6.150×10^-3C-0.020AB-2.700×10-3AC-8.900×10-3BC0.056A²-0.079B²-0.031C²。其分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型p＜0.0001，說(shuō)明試驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)模型差異極顯著。失擬項(xiàng)p＞0.05，表示不顯著，即該模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)的擬合程度良好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。其中R²=0.9932，表明自變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，調(diào)整系數(shù)R²_Adj=0.9845，說(shuō)明該模型能夠解釋98.45%的響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差小，可以運(yùn)用此模型對(duì)靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A、B、C對(duì)響應(yīng)值三萜得率的影響達(dá)到顯著水平，二次項(xiàng)A²、B²、C²對(duì)其影響極顯著，AB、BC交互作用顯著說(shuō)明不同提取條件與靈芝發(fā)酵粉三萜提取得率之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

②響應(yīng)面交互作用分析

為確定各因素交互作用對(duì)靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取得率的影響，根據(jù)二次模擬回歸方程繪出響應(yīng)面及等高線圖，見(jiàn)圖7至圖9。

圖7、圖9等高線形狀為橢圓形，而圖8等高線形狀為圓形，表明料液比和回流時(shí)間、回流時(shí)間和回流溫度的交互作用顯著，料液比和回流溫度的交互作用不顯著。

③最佳提取條件確定

通過(guò)回歸方程求得優(yōu)化后的三萜化合物提取條件為：料液比1∶30.66（g/mL）、回流時(shí)間2.94h，回流溫度84.53℃。為方便試驗(yàn)操作，調(diào)整條件為料液比1∶30（g/mL）、回流時(shí)間3h、回流溫度85℃。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得三萜類(lèi)化合物的平均得率為0.6760mg/g，與預(yù)測(cè)值0.6694mg/g相比誤差為0.98%，可見(jiàn)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的三萜化合物的提取條件比較可靠。

2、靈芝三萜粗提物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

（1）靈芝三萜的高效液相色譜檢測(cè)

靈芝三萜粗提物經(jīng)二次柱層析分部收集后，合并單一斑點(diǎn)的流分進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖10。

由圖10可以看出，流動(dòng)相為2%乙酸溶液∶乙睛=70∶30時(shí)，檢測(cè)出樣品中有2個(gè)峰，說(shuō)明樣品中有2個(gè)不同組分，分別保留時(shí)間4.039min、4.234min。

（2）紫外光譜掃描分析

由圖11可知，該物質(zhì)紫外譜圖在280nm、260nm波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)前期硅膠柱層析后得到的三萜類(lèi)化合物比較純，基本不含有蛋白質(zhì)及核酸等雜質(zhì)。其最大吸值在波長(zhǎng)237nm處，具有靈芝三萜的特征吸收峰。根據(jù)規(guī)律可得到在靈芝三萜化合物中C11位沒(méi)有羰基，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在共軛雙鍵，其吸收強(qiáng)度大多在l0gε3.7～4.1之間。

（3）紅外光譜掃描分析

由圖12可知，在3446cm-1處有一組比較寬的強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明存在分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)；1137cm^-1處有一組強(qiáng)吸收峰，表明該物質(zhì)分子中含有羥基；在2360cm^-1處的吸收峰表明該物質(zhì)中含有羧基；在1647cm^-1處有較強(qiáng)的吸收峰，則表明該物質(zhì)中含有α、β-不飽和酮；而在1458cm^-1～1217cm^-1中的1294cm^-1、1398cm^-1處的吸收峰是多氫菲環(huán)的特征吸收峰。綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環(huán)三萜化合物。
綜合以上分析，推斷該流分化合物為含有羥基的四環(huán)三萜化合物。

三、結(jié)論

采用回流提取法提取靈芝發(fā)酵粉中的三萜化合物，經(jīng)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)該提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比=1∶30（g/mL）、回流時(shí)間為3h，回流溫度為85℃。在此條件下提取三萜類(lèi)化合物的平均得率為0.6760mg/g。

通過(guò)硅膠柱層析分級(jí)得到1組流分，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該組流分含有2個(gè)組分。對(duì)純化后的靈芝三萜樣品進(jìn)行了紅外和紫外結(jié)構(gòu)分析，確定靈芝發(fā)酵粉中其中一流分為含有羥基的四環(huán)三萜化合物，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在有共軛雙鍵。通過(guò)對(duì)靈芝三萜化合物提取和結(jié)構(gòu)初步鑒定，不僅為產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)提供的理論基礎(chǔ)，可以更好的了解其功能性。

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