（2）蒽酮溶液添加量的選擇

分別吸取2.0mL樣品于25mL具塞試管中，分別加入濃度為3.0g·^L-1的蒽酮溶液各8.0、9.0、10.0、11.0、12.0mL，搖勻后立即于沸水浴中加熱10min，取出后迅速在流水中沖洗，冷卻至室溫，于490nm波長下測定吸光度值，測定結果見圖3。由圖可知，隨著蒽酮添加量的增多，吸光度先升高后降低，在蒽酮添加量達到10mL時，吸光度為0.733，達到最大值，說明蒽酮溶液添加量為10mL時，多糖脫水生成的糠醛或其衍生物，與蒽酮反應完全，由此可知，蒽酮硫酸加入量應選擇在10mL為宜。

（3）硫酸濃度對測定結果的影響

分別吸取2.0mL樣品于25mL具塞試管中，分別加入以80%、85%、90%、95%、100%的硫酸為溶劑配制成3.0g·L^-1的蒽酮溶液，混勻后于沸水浴加熱10min，取出后迅速在流水中沖洗，使其冷卻至室溫，于490nm波長下測定吸光度值，測定結果見圖4。由圖可知隨著硫酸濃度的升高，吸光度值逐漸升高。當硫酸濃度為90%時，吸光度為0.744，達到最高值；當硫酸濃度超過90%后，吸光度逐漸平穩(wěn)，說明在硫酸濃度為90%時，多糖在此條件下脫水完全；若酸不足，則多糖不能完全脫水；過酸條件下會使顯色的物質分解，由此可知，硫酸濃度應選擇在90%為宜。

（4）顯色時間的選擇

分別吸取2.0mL樣品于25mL具塞試管中，分別加入濃度為3.0g·L^-1的蒽酮溶液10mL，混勻后于沸水浴加熱2、5、10、15和20min，取出后迅速在流水中沖洗，使其冷卻至室溫，于490nm波長下測定吸光度值，測定結果見圖5。由圖可知，隨著水浴時間的增加，吸光度值先升高后降低，當水浴時間達到10min時，吸光度達到最大值0.739；繼續(xù)加熱，吸光度反而下降。原因可能是加熱時間過長，多糖的結構被破壞，有效成分降解，從而造成損失，所以水浴時間不宜過長。

3、正交試驗設計試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，確定蒽酮濃度為3.0g·L^-1，不選入優(yōu)化試驗。選擇蒽酮添加量（A）、硫酸濃度（B）、水浴時間（C）三個因素進行優(yōu)化。利用正交試驗設計，選用L₉（3⁴）正交試驗設計表進行優(yōu)化，試驗設計和結果見表1，方差分析結果見表2。

由表1和表2可知，試驗設計所用三個因素中，對蒽酮-硫酸法測定秋葵多糖的吸光度值的影響主次順序為A＞D＞B，即蒽酮添加量＞顯色時間＞硫酸濃度。蒽酮-硫酸法測定秋葵多糖的最佳條件為濃度為3.0g·L^-1的蒽酮添加量為10mL，硫酸濃度為90%，顯色時間為10min。在此組合下進行驗證試驗，秋葵多糖吸光度值平均值達到0.756，優(yōu)于試驗設計表中的最高得分，由此確定蒽酮-硫酸法測定秋葵多糖的測定條件為3.0g·L^-1的蒽酮添加量為10mL，硫酸濃度為90%，沸水浴顯色時間為10min，檢測波長為490nm。

4、標準曲線的繪制

分別準確移取2mL系列標準溶液于25mL具塞試管中，以2mL蒸餾水為空白，在優(yōu)化所得蒽酮-硫酸法的最優(yōu)條件，測定葡萄糖系列標準溶液的吸光度值，以葡萄糖濃度和吸光度值的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，結果見圖6，標準曲線方程為y=4.22236x+0.0037，單位為mg·mL^-1，相關系數(shù)R²=0.9996。

5、換算因子的測定結果

在優(yōu)化后的蒽酮硫酸法測定條件下，于490nm波長下平行測定三組秋葵精制多糖溶液的吸光度值，按回歸方程計算出葡萄糖含量為：0.166mg·mL^-1，將其帶入公式1中，計算出換算因子f=1.20。

6、精密度試驗結果

精密度試驗是指對同一秋葵多糖樣品，采用完全一致的測定條件，得到的多個結果之間相互符合的程度。相對標準偏差越小，表示多次測定后的樣品所得結果之間越相近，則精密度越高。依據(jù)精密度試驗所得的秋葵多糖含量4.96%、4.99%、4.96%、4.93%、4.90%和4.90%，計算得出相對標準偏差為0.73%，說明優(yōu)化后的該方法精密度較高，可以用于秋葵多糖的測定。

7、秋葵多糖含量的測定結果

將秋葵樣品在優(yōu)化后的蒽酮硫酸條件下平行測定3次，其在490nm波長下測得吸光度值，由公式2計算得出秋葵多糖的含量分別為4.96%、4.90%和4.99%，平均值為4.95%，與張紅瑞等人的實驗結果相近。

三、結論

本文優(yōu)化了蒽酮-硫酸法測定秋葵多糖的檢測條件，并確定了換算因子?？疾燧焱獫舛取?u>硫酸濃度、蒽酮硫酸加入量和水浴時間對測定效果的影響，利用正交優(yōu)化試驗確定蒽酮法測定秋葵多糖的最優(yōu)測定條件。試驗得最優(yōu)測定條為蒽酮濃度3.0g·L^-1、硫酸濃度90%、蒽酮硫酸加入量10mL、顯色時間10min，在此條件下達到最優(yōu)效果，并確定了換算因子為1.20，精密度RSD為0.73%。在此條件下，測得秋葵多糖含量為4.95%。該方法操作較簡單、精密度高、結果證明在此條件下，利用蒽酮-硫酸法測定秋葵多糖含量具有操作簡便、精密度高、測定成本低，設備要求低，適合于一般秋葵企業(yè)使用。

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