秋葵俗名羊角豆、補(bǔ)腎果等，有蔬菜王之稱。秋葵原產(chǎn)于非洲，但現(xiàn)在以推廣到東南亞、中東、南美等地區(qū)種植。秋葵富含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮類化合物等，具有極高的營(yíng)養(yǎng)食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。秋葵含有的多糖成分具有降脂、降壓、抗癌、抗熱應(yīng)激性等生理活性，有增強(qiáng)體質(zhì)和抗疲勞等保健作用，因此受到研究人員的額外關(guān)注。

目前，秋葵多糖的測(cè)定方法主要有化學(xué)法和色譜法，其中化學(xué)法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。其中蒽酮-硫酸法是測(cè)定多糖成分常用的一種化學(xué)方法，其測(cè)定原理是利用濃硫酸對(duì)樣品中的多糖成分水解、脫水，再與蒽酮結(jié)合成有色化合物，利用分光光度計(jì)于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。此方法相比較于色譜法具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、測(cè)定快速、測(cè)定成本低的優(yōu)點(diǎn)，但該方法穩(wěn)定性需要控制好測(cè)定條件，如蒽酮試劑現(xiàn)用現(xiàn)配、注意避光，同時(shí)還需注意針對(duì)不同樣品多糖成分的測(cè)定其最優(yōu)測(cè)定條件的選擇。所以本文探討利用蒽酮-硫酸法測(cè)定秋葵多糖，不同測(cè)定條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)確定最優(yōu)檢測(cè)條件，從而確定蒽酮-硫酸法測(cè)定秋葵多糖含量的檢測(cè)條件，為秋葵多糖的開發(fā)利用提供檢測(cè)依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與儀器

秋葵粉：豪州市保華藥業(yè)有限公司；蒽酮（分析純）：上海國(guó)藥試劑集團(tuán)；葡萄糖（分析純）：萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠；722可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2、試驗(yàn)方法

（1）秋葵多糖的提取和精制

稱取5g秋葵粉加入325mL蒸餾水，在90℃水浴中提取3h，過(guò)濾后，減壓濃縮至100mL。按照濃縮液∶氯仿∶正丁醇為20∶4∶1的比例進(jìn)行混合除去蛋白（Savage法），轉(zhuǎn)移上清液于燒杯中，加入乙醇使乙醇濃度達(dá)80%，靜置過(guò)夜后，過(guò)濾收集沉淀物。利用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌沉淀物，在室溫下干燥至恒重，得精制秋葵多糖備用。稱取上述精制秋葵多糖5mg，用蒸餾水復(fù)溶，移至50mL容量瓶中，配置成0.1mg·mL-1的精制秋葵多糖溶液。

（2）蒽酮-硫酸溶液的配制

精密稱量一定質(zhì)量的蒽酮，以硫酸為溶劑配制成試驗(yàn)中需要的濃度，搖勻后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

首先葡萄糖干燥至恒重，再稱取0.1000g干燥至恒重的葡萄糖，以蒸餾水為溶劑，定容于100mL容量瓶中，得1.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（4）最大吸收波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確量取秋葵多糖溶液2mL于25mL的具塞試管中，加入3.0g·L^-1蒽酮-硫酸溶液10mL，搖勻后立即放入沸水浴中加熱10min，取出后迅速在流動(dòng)的水中沖洗，使其冷卻至室溫后，在480～550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

（5）蒽酮-硫酸法測(cè)定條件的單因素和優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察蒽酮濃度、硫酸濃度、蒽酮溶液添加量、顯色時(shí)間四個(gè)因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定優(yōu)化試驗(yàn)因素，選用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，從而確定蒽酮-硫酸法測(cè)定秋葵多糖的檢測(cè)條件。

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確移取0.0、1.0、2.5、5.0、7.5、10mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻后得濃度分別為0.00、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg·mL^-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列使用溶液。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液2mL于25mL的具塞試管中，在優(yōu)化后的測(cè)定條件下測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（7）秋葵測(cè)定樣品液的制備

精密稱取秋葵粉1.0g，加入100mL蒸餾水，混勻后，在90℃水浴中提取3h，過(guò)濾后，減壓濃縮至50mL。利用Savage法除去蛋白，上清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容得待測(cè)液。

（8）精密度試驗(yàn)

精密吸取2mL秋葵待測(cè)液和2mL蒸餾水于2支25mL具塞試管中，在優(yōu)化后的測(cè)定條件下測(cè)定，樣品測(cè)定平行6次。

（9）換算因子的測(cè)定

取0.1mg·mL^-1精制秋葵多糖溶液2mL，按照優(yōu)化測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算獲得以葡萄糖表示的秋葵多糖濃度。按下式計(jì)算換算因子：

式中：C1—精制多糖溶液中多糖的濃度，單位為mg·mL^-1；

C2—優(yōu)化方法測(cè)得的以葡萄糖表示的秋葵多糖濃度，單位為mg·mL^-1。

（10）秋葵多糖含量的計(jì)算秋葵多糖含量的計(jì)算公式如下：

式中：C—樣品中含有的葡萄糖質(zhì)量濃度，單位mg·mL^-1；

D—秋葵樣品溶液的稀釋倍數(shù)；

f—換算因子；

m—秋葵粉樣品的質(zhì)量，單位mg。

二、結(jié)果與分析

1、測(cè)定波長(zhǎng)的確定

利用分光光度計(jì)在480～550nm波長(zhǎng)的范圍內(nèi)，每間隔10nm測(cè)定秋葵多糖溶液的吸光度，結(jié)果見圖1。如圖可知，利用蒽酮-硫酸法測(cè)定秋葵多糖測(cè)定液在490nm處有最大吸收峰，因此確定490nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2、蒽酮法測(cè)定秋葵多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）蒽酮濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響
 

移取2.0mL樣品于25mL具塞試管中，分別加入濃度為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0g·L^-1的蒽酮溶液10mL，混勻后于沸水浴加熱10min，取出后迅速在流水中沖洗，冷卻至室溫，于490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著蒽酮濃度的升高，吸光度值逐漸升高，在蒽酮濃度達(dá)到3.0g·L^-1時(shí)，吸光度為0.721，達(dá)到最高值；繼續(xù)增加蒽酮濃度，吸光度變化較小，因此確定蒽酮濃度為3.0g·L^-1時(shí)，蒽酮和多糖的反應(yīng)完全。

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