灰樹花（Grifolafrondosa）一種名貴的藥食用真菌，以子實體或菌絲體作為食用部分，具有多種活性功能，如：抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤、清除重金屬，并且含有較為豐富的生物活性物質(zhì)，如，灰樹花多糖、多酚、甾醇類、萜類等活性成分。傳統(tǒng)灰樹花固態(tài)培養(yǎng)主要是利用木屑、稻草以及農(nóng)作物副產(chǎn)品作為生長基質(zhì)，灰樹花采收后，菌糠則被丟棄，造成很大的資源浪費及環(huán)境污染。

開發(fā)一種新型的灰樹花生長基質(zhì)，并完全利用其發(fā)酵基質(zhì)具有很高的研究價值。通過前期的實驗將已優(yōu)化的苦蕎、薏仁米等各種基質(zhì)的比例作為灰樹花發(fā)酵基質(zhì)進行實驗?？嗍w作為西南地區(qū)一種藥食同源谷物富含黃酮類物質(zhì)，其蘆丁含量極高，薏仁米復(fù)含薏仁酯、薏仁素和豐富的淀粉物質(zhì)，兩者可以作為灰樹花發(fā)酵基質(zhì)，為灰樹花的生長提供碳氮源。

天麻（Rhizomagastrodiae）一種名貴中藥，復(fù)含天麻素（p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside，GA）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzylalcohol，HA）、對羥基苯甲醛（p-hydroxylbenzaldehyde，HBA）、巴利森苷，具有很高的藥理功效。課題組前期試驗驗證了添加一定比例的天麻提取物參與灰樹花液態(tài)深層發(fā)酵能夠顯著地促進灰樹花胞外多糖的分泌及生物量的增加以及分解利用天麻成分進行生物轉(zhuǎn)化。將中藥天麻以不同比例的添加量參與灰樹花的固態(tài)發(fā)酵，進一步豐富和拓展中藥資源與食用菌共發(fā)酵以及兩者之間相互影響、生物轉(zhuǎn)化的研究前景以及中藥菌質(zhì)產(chǎn)品的食藥價值。

1材料與方法

1.1材料與試劑

灰樹花（Grifolafrondosa，菌種編號：5.404）；天麻，貴州大方；苦蕎，貴州威寧；薏仁米，貴州興仁；天麻素對照品、對羥基苯甲醇對照品、對羥基苯甲醛對照品、巴利森苷對照品、蘆丁對照品、異槲皮苷對照品；無水硝酸鋁、亞硝酸鈉；其余試劑均為市售分析純

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基

1.2儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋；SW-CJ-1D型凈化工作臺；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機；CTFD-12S型真空冷凍干燥機；恒溫培養(yǎng)箱；Agilent1100型高效液相色譜儀及檢測器、Agilent5TC-C18型色譜柱

1.3實驗方法

1.3.1灰樹花固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制流程示意圖

1.3.2灰樹花菌種培養(yǎng)方法

1.3.2.1斜面種子培養(yǎng)

從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)皿中部，25℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿整個斜面，轉(zhuǎn)置4℃保存。

1.3.2.2發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分組成：苦蕎粉：4.5g；苦蕎皮：1.5g；薏仁米：1.5g；麩皮：0.4g；葡萄糖：0.1g；

天麻粉：天麻烘干，超微粉碎機打碎成天麻粉，過60目篩。分別按照培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0、10%、20%、30%、40%、50%加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中參與固態(tài)發(fā)酵。

將上述材料混勻加水，置于滅菌鍋中滅菌（121℃、30min），培養(yǎng)基降低到室溫，接入灰樹花菌種于培養(yǎng)基中，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行生長發(fā)酵12d（25℃）

1.3.3發(fā)酵基質(zhì)的處理

發(fā)酵基質(zhì)在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后，將其進行真空冷凍干燥，干燥之后的發(fā)酵物超微粉碎并過80目篩，收集粉末，置于-20℃條件下保存，作為實驗材料。

1.4分析方法

1.4.1總黃酮含量的測定

精確稱取0.4g菌粉，加入20mL50%的乙醇中，常溫?fù)u晃提取1h，8000r/min離心10min，取上清液，作為待測樣品溶液。采用NaNO2、Al（NO3）3顯色法測量，總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量表示。

1.4.2天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷含量的測定

1.4.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent5TC-C18型色譜柱（250mm×4.6mm，5µm）；洗脫程序：0~35min（0%~30%B），35~40min（30%~100%B），40~45min（100%~3%B）；流動相：0.1%的磷酸水（D）、乙腈（B）；流速：1mL/min；檢測波長：221nm；柱溫：30℃

1.4.2.2樣品溶液的配制

精確稱取0.5g發(fā)酵粉末，加入10mL75%乙醇，常溫浸提12h，8000r/min離心10min，取上清液，作為待測樣品溶液，按照上述高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）條件進行天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷含量的測定，將各種物質(zhì)的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各種物質(zhì)的含量。

1.4.3蘆丁、異槲皮苷含量的測定

1.4.3.1色譜條件

流動相：0.02%的磷酸水、乙腈；流速：1mL/min；檢測波長：360nm；柱溫：30℃；等度洗脫：V（乙腈）∶V（0.02%磷酸水）=20∶80

1.4.3.2樣品溶液的配制

精確稱取0.5g發(fā)酵粉末，加入10mL甲醇，常溫浸提12h，8000r/min離心10min，取上清液，作為待測樣品溶液，按照上述HPLC條件進行蘆丁、異槲皮苷含量的測定，將各種物質(zhì)的峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各種物質(zhì)的含量。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)使用Origin10軟件畫圖，使用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（m±SD）表示（n=3），使用單因素方差分析（ANOVA）和配對t-檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1灰樹花固態(tài)發(fā)酵不同時間形態(tài)及表觀結(jié)構(gòu)的變化

圖1為灰樹花在未添加天麻培養(yǎng)基上生長變化。在生長7d時，灰樹花菌絲體基本鋪滿培養(yǎng)基，且菌絲顏色亮白，聯(lián)結(jié)致密，說明灰樹花能夠在基質(zhì)上進行正常的生長，此種培養(yǎng)基未對灰樹花的生長產(chǎn)生抑制作用。

圖2為發(fā)酵組和未發(fā)酵組在不同天數(shù)時菌質(zhì)的表觀形態(tài)圖。由圖2可知，在發(fā)酵組，隨著灰樹花發(fā)酵時間的延長，基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大量細微的孔隙，在發(fā)酵終點時，基質(zhì)由外到內(nèi)均產(chǎn)生了較大的孔隙，結(jié)構(gòu)近乎崩解，相比于發(fā)酵組，未發(fā)酵組基質(zhì)在0~12d的表觀結(jié)構(gòu)形態(tài)均未發(fā)生明顯的變化，結(jié)構(gòu)均較為完整致密。

對比兩者基質(zhì)的表觀結(jié)構(gòu)，說明經(jīng)灰樹花發(fā)酵，對基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的崩解作用，通過對基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，使得基質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)更容易析出，增加了菌絲體與基質(zhì)的接觸面積，有利于菌絲體更好地吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)提供自身的生長代謝。

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