當(dāng)前對(duì)映異構(gòu)體（對(duì)映體）的拆分方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳法（CE），其中HPLC法又分為柱前衍生法、手性流動(dòng)相添加法和手性固定相法。柱前衍生法前處理復(fù)雜且時(shí)間長(zhǎng)；以CuSO₄和手性氨基酸為手性流動(dòng)相的方法已普遍用于喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)映體的拆分，原理為待測(cè)物可與Cu²⁺及手性氨基酸形成三元非對(duì)映體配位化合物而分離，該法適用于手性碳原子與手性配合部位距離較近的化合物分離，如氧氟沙星、帕珠沙星等，但對(duì)于手性碳與手性配合部位距離較遠(yuǎn)的藥物卻無(wú)法拆分，如手性碳在哌嗪側(cè)鏈上的洛美沙星和加替沙星，熊正平等嘗試采用過(guò)L-脯氨酸與CuSO₄的手性流動(dòng)相添加劑法來(lái)拆分洛美沙星對(duì)映體未能成功。

手性固定相法利用藥物對(duì)映體和固定相之間所形成的非對(duì)映體復(fù)合物穩(wěn)定性差異而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的拆分，雖然手性色譜柱較貴，但優(yōu)點(diǎn)是適用于不含活潑反應(yīng)基團(tuán)的化合物，且樣品處理步驟簡(jiǎn)單，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在藥物對(duì)映體拆分上。本文利用以鍵合了苯基氨基甲酸酯化β-環(huán)糊精的手性色譜柱（ChiralCD-Ph）對(duì)加替沙星對(duì)映體進(jìn)行了拆分研究。

1材料

1.1儀器

LC-AD高效液相色譜儀，METTLERMS205DU電子天平。

1.2藥品與試劑

加替沙星對(duì)照品（130518-200402，含量：97.2%；旋光度測(cè)定為0°，認(rèn)為左右旋加替沙星比例為1∶1）；加替沙星片（180801）；水為純化水，HClO₄和NaClO₄為分析純，甲醇、乙腈為色譜純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

流動(dòng)相：0.5mol·L^-1NaClO₄溶液（用HClO4調(diào)節(jié)pH值至4.0）-甲醇（53∶47）；流速：1.0mL·min^-1；色譜柱為ChiralCD-Ph（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：292nm。

2.2溶液的制備

精密稱(chēng)取加替沙星對(duì)照品適量，加50%的甲醇溶解并稀釋成含加替沙星約為2mg·mL^-1的對(duì)照品溶液。取加替沙星片研細(xì)，精密稱(chēng)取適量，用50%的甲醇溶解并稀釋成含加替沙星約為1mg·mL^-1的供試品溶液。

2.3鹽和有機(jī)相的選擇

分別以甲酸銨、KH₂PO₄和NaClO₄作為流動(dòng)相對(duì)加替沙星進(jìn)行拆分，結(jié)果顯示甲酸銨和KH₂PO₄系統(tǒng)均無(wú)法拆分加替沙星，而NaClO₄系統(tǒng)有拆分加替沙星的可能。以NaClO₄為水相，分別以甲醇和乙腈為有機(jī)相對(duì)加替沙星進(jìn)行拆分，結(jié)果顯示乙腈拆分效果很差，幾乎無(wú)法拆分加替沙星，而甲醇拆分效果較好，最終選擇甲醇進(jìn)行研究。

2.4NaClO₄濃度的選擇

以NaClO₄-甲醇為流動(dòng)相，嘗試NaClO₄濃度為0.1、0.3和0.5mol·L^-1時(shí)對(duì)拆分結(jié)果的影響，結(jié)果兩對(duì)映體間分離度分別為1.092、1.483和1.602，最終選擇濃度為0.5mol·L^-1的HClO₄進(jìn)行研究。

2.5甲醇比例的選擇

甲醇50%時(shí)對(duì)映體保留時(shí)間約為34min，對(duì)映體間分離度1.498；加大甲醇比例兩對(duì)映體間分離度更小，減少比例分離度有加大趨勢(shì)，但保留時(shí)間太長(zhǎng)，綜合考慮選擇甲醇比例為47%進(jìn)行研究。

2.6系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)照品溶液，按“2.1”中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖詳見(jiàn)圖2。圖譜顯示加替沙星兩個(gè)對(duì)映體間保留時(shí)間分別約為34和39min，兩對(duì)映體峰間的分離度為1.6，符合《中國(guó)藥典》2015年中待測(cè)物質(zhì)色譜峰間的分離度應(yīng)大于1.5的要求。

2.7線性關(guān)系考察

取對(duì)照品溶液適量，分別加50%甲醇分別稀釋成含加替沙星100、250、500、750、1000和1500μg·mL^-1的溶液（單個(gè)對(duì)映體濃度為加替沙星濃度的50%），按“2.1”中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以加替沙星單個(gè)對(duì)映體的峰面積為縱坐標(biāo)（y），加替沙星單個(gè)對(duì)映體的濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，加替沙星單個(gè)對(duì)映體濃度在50～750μg·mL^-1之間與相應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系。對(duì)映體1回歸方程為：y=52819x+44509，r2=0.9999；對(duì)映體2回歸方程為：y=56850x+404273，r2=0.9999。

2.8精密度和重復(fù)性

取加替沙星濃度約為1mg·mL^-1的對(duì)照品溶液，按“2.1”中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。按“2.2”中方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”中色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。分別計(jì)算加替沙星每個(gè)對(duì)映體峰面積的RSD，結(jié)果均小于1%，說(shuō)明本方法精密度和重復(fù)性良好。

2.9定量限與檢出限考察

取對(duì)照品溶液倍比稀釋?zhuān)?ldquo;2.1”中色譜條件測(cè)定，以信噪比滿(mǎn)足3∶1和10∶1計(jì)算檢出限和定量限。結(jié)果本方法加替沙星單個(gè)對(duì)映體的檢出限和定量限分別為1.5和5μg·mL^-1。

2.10樣品測(cè)定

取供試品溶液按“2.1”中色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品中對(duì)映體1和對(duì)映體2峰面積比值平均為48.3∶51.7，與對(duì)照品溶液對(duì)映體峰面積比接近，表明供試品溶液中兩對(duì)映體含量近似一致。

3結(jié)論

本研究使用手性色譜柱ChiralCD-Ph成功拆分了加替沙星對(duì)映體，以0.5mol·L^-1NaClO4溶液（pH值4.0）-甲醇（53∶47）為流動(dòng)相時(shí)，加替沙星兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體分離度最佳，解決了手性流動(dòng)相方法無(wú)法拆分加替沙星的難題。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，精密度和重復(fù)性良好、靈敏度高，可用于加替沙星光學(xué)純度的測(cè)定和質(zhì)量控制。

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