槐米是豆科植物槐的干燥花蕾，有涼血止血，清肝瀉火等功效。蘆丁為槐米的主要活性成分，目前我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)中常以槐米為主要原料提取蘆丁，含量最高可達(dá)30%左右。蘆丁屬于黃酮類(lèi)化合物，研究表明，蘆丁具有抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化、延緩衰老等作用。蘆丁可以直接作為藥品，也用于復(fù)配和藥物的中間體，可用作抗氧劑及天然食用黃色素。國(guó)外主要用于食品、化妝品的添加劑和著色劑。

本實(shí)驗(yàn)建立了槐米中蘆丁含量測(cè)定的高效液相色譜方法，參考JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》建立數(shù)學(xué)模型，定量測(cè)定不確定度的各個(gè)分量，考察影響不確定度的主要因素，初步建立了適用于評(píng)估HPLC法測(cè)定槐米中蘆丁含量不確定度的方法，以期加強(qiáng)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和可信度的認(rèn)識(shí)，為樣品前處理步驟繁瑣的分析方法建立有效的不確定度評(píng)定程序提供參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量HPLC：90.5%）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純；槐米藥材收集于山西、陜西和廣西等地，經(jīng)山西省林業(yè)科學(xué)研究院張素華高級(jí)工程師鑒定為豆科植物槐SophorajaponicaL的花蕾。

2、儀器與設(shè)備

LC-2010AHT高效液相色譜儀；AB104.N分析天平；KQ3200DE數(shù)控超聲清洗器；UPHW-I-90T型優(yōu)普系列超純水系統(tǒng)。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品5.4mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.0979g／L的儲(chǔ)備液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）供試品溶液的制備

稱(chēng)取槐米粗粉約0.1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30分鐘，放冷后再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過(guò)作為供試品溶液。同時(shí)以甲醇做空白對(duì)照溶液。

（3）色譜條件

色譜柱：Agela.InnovalC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；柱溫：30℃；流速：1.0mL／min。流動(dòng)相∶甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm，進(jìn)樣量：10μL。

4、數(shù)學(xué)模型

槐米中蘆丁的計(jì)算公式為：

式中：X為樣品中蘆丁含量，%；C為供試液中蘆丁濃度，g／L；V為供試液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；F為稀釋因子。

5、不確定度來(lái)源分析

本方法操作步驟相對(duì)復(fù)雜，影響因素較多，通過(guò)分析整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的影響因素，并參照含量計(jì)算公式，分析不確定來(lái)源主要包括：樣品制備均勻度、樣品的定容、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合和儀器重復(fù)性等方面。

二、來(lái)源與分析

1、樣品制備均勻度引入的不確定度

被測(cè)樣品花蕾不同部位的蘆丁含量差異較大，按照標(biāo)準(zhǔn)取樣方法，將同一批次樣品全部粉碎混勻后，稱(chēng)取10份按槐米粗粉約0.1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30分鐘，放冷后再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過(guò)作為供試品溶液。同時(shí)以甲醇做空白對(duì)照溶液分別測(cè)定，評(píng)定樣品制備的均勻度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。另外重復(fù)性測(cè)量已包括在樣品均勻度的試驗(yàn)中。

蘆丁含量的平均值：X-=18.54%

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差Sx用貝塞爾公式計(jì)算：

樣品分布均勻度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（x）為：

2、樣品定容引入的不確定度

（1）由校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》，A級(jí)50mL單標(biāo)線(xiàn)吸量管最大允差為±0.050mL，A級(jí)2mL分度吸量管最大允差為±0.012mL，A級(jí)10mL單標(biāo)線(xiàn)容量瓶最大允差為±0.020mL，屬B類(lèi)評(píng)定，按照矩形分布考慮，k=根號(hào)3，合成校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度：

（2）由溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在樣品處理過(guò)程中需量取甲醇50mL、續(xù)濾液2mL并定容至10mL，實(shí)驗(yàn)室的溫度在±4℃之間變動(dòng)，20℃甲醇體積膨脹系數(shù)為1.19×10-³／℃。在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，移液管和容量瓶中的溶液所處環(huán)境的溫度差異很小，因此可以忽略不計(jì)。假設(shè)溫度變化是矩形分布，由溫度變化產(chǎn)生的不確定度根據(jù)公式（2）計(jì)算，結(jié)果為：u（t₁)=0.137,u(t₂)=0.00550,u(t₃)=0.0275

合成溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由上述分量合成樣品定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

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