鲊廣椒，也稱為鲊?yán)苯贰Ⅶ嚱鸾坊蝼嚭＝?，口感微辣且偏酸，在我?guó)湖北、湖南、重慶和貴州等地頗為流行，常作為佐料用于菜肴的烹飪。由于各地用于鲊廣椒制作的食材、工藝條件和氣候環(huán)境不同，因而制作出的鲊廣椒品質(zhì)也不盡相同。湖北荊州地區(qū)的作廣椒主要是以大米和紅辣椒為主要原料，通過密封發(fā)酵制作而成。采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，王玉榮對(duì)湖北省當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，94.25％的細(xì)菌隸屬于乳酸桿菌屬，乳酸菌為鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，究其原因可能在于鲊廣椒發(fā)酵環(huán)境相對(duì)密封，發(fā)酵罐中氧氣的含量相對(duì)較低，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供了適宜的條件。

由于產(chǎn)業(yè)化程度較低，加之其制作環(huán)境相對(duì)開放，除乳酸菌外鲊廣椒中亦可能含有其他微生物種群。采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，王玉榮對(duì)湖北宜昌地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有大量的Staphyococus(葡萄球菌屬)、Enterobacter(腸桿菌屬)和Klebsiella(克雷伯氏桿菌)等條件致病菌。采用乳酸菌純種發(fā)酵制備作廣椒，可以改善自然發(fā)酵的諸多弊端，在提升食品安全性的同時(shí)，亦可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)，因而更符合消費(fèi)者的消費(fèi)需求。研究人員可采用電子舌和電子鼻等仿生技術(shù)對(duì)食品滋味和氣味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有結(jié)果準(zhǔn)確且受主觀因素影響小的優(yōu)點(diǎn)，兩種技術(shù)相結(jié)合更是廣泛的應(yīng)用于肉制品、調(diào)味品、蒸餾酒、豆瓣醬、果汁、牛奶和咖啡等食品品質(zhì)評(píng)價(jià)中。

本研究從湖北荊州采集了10個(gè)鲊廣椒樣品，采用純培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合的手段，在解析鲊廣椒中乳酸菌多樣性的同時(shí)，對(duì)其蘊(yùn)含的乳酸菌菌種資源進(jìn)行了分離鑒定。在使用乳酸菌分離株進(jìn)行鲊廣椒純培種發(fā)酵的基礎(chǔ)上，結(jié)合電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過本研究的實(shí)施，以期為湖北荊州地區(qū)鲊廣椒微生物多樣性的解析和后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化的推動(dòng)提供一定的理論依據(jù)和菌株支持。

一、材料與方法

1、材料與試劑

鲊廣椒：采集白湖北省荊州市城南菜市場(chǎng)和兩湖農(nóng)產(chǎn)品交易物流中心蔬菜批發(fā)市場(chǎng)，共采集10個(gè)；大米、辣椒、花椒、白胡椒、鹽和白酒：購(gòu)于襄陽(yáng)市609航空航天研究所鑫源超市；MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；AxygenPCR清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；DL2000Marker、PCRbuffer、rTaqDNA聚合酶和pMDl8-T克隆載體：寶生物工程(大連)有限公司；蛋白酶K和DNTPMix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、乙酸鈉、乙醇、酚、氯仿和異戊醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Escherichiacolitopl0：由鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所制備并保存；引物：27F(5’-AGAGTITGATCCTGGcTCAG-3’)和反向引物1495R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)：由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；電子舌測(cè)試用參比溶液、內(nèi)部溶液、外部溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液：日本Insent公司。

2、儀器與設(shè)備

YL90-2磨面機(jī)：上海捷朗機(jī)電有限公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)DonWhitley公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海-恒科學(xué)儀器有限公司；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；ECLIPSECi生物顯微鏡：日本Nikon公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；PTC-100PCR儀：美國(guó)ABI公司；FluorChemFC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；SA402B味覺分析系統(tǒng)，配備5個(gè)傳感器：日本Insent公司；PEN3型電子鼻，配備10個(gè)金屬氧化傳感器：德國(guó)Airsense公司。

3、試驗(yàn)方法

（1）乳酸菌的分離

采用倍比稀釋法將鲊廣椒樣品進(jìn)行稀釋，取稀釋液涂布于添加1.0％CaC0₃的MRS固體培養(yǎng)基上，于厭氧條件下(85％N₂，5％C0₂及10％H₂)37℃培養(yǎng)48h，挑取形態(tài)不同且有透明圈的單菌落進(jìn)行菌株分離。菌株純化3代后，將革蘭氏染色為陽(yáng)性且過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性的菌株判定為疑似乳酸菌菌株，菌體離心后加入濃度為30％的甘油，于-80℃超低溫冰箱中凍藏備用。

（2）乳酸菌的鑒定

使用CTAB法提取疑似乳酸菌的DNA，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2.5μL10×PCRBuffer(含M9²⁺)，2μLdNTP(2.5mol／L)，正反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq(5U／μL)，1μLDNA模板，18.3μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min為預(yù)變性；95℃變性45S，55℃退火45S，72℃延伸90S，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取2.5μL的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用清潔試劑盒將染色后有清晰明亮條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔，并連接到T載體中然后轉(zhuǎn)化至Escherichiacolitopl0中，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的克隆子寄往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將反饋后的測(cè)序結(jié)果拼接后在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，選取相似度在99％及以上的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）鲊廣椒的制作

將大米粉碎至粒度約為4～6mm，稱取大米粉750g、花椒粉3.15g、胡椒粉3.15g、切碎的紅二荊條辣椒225g和食鹽75g，按照5×10⁶／g鲊廣椒原料的比例分別接入乳酸菌菌泥，攪拌均勻后裝入2L玻璃泡菜壇中并噴灑3mL白酒，純水將泡菜壇封口后置于30℃培養(yǎng)20d。同時(shí)以不添加乳酸菌菌株的鲊廣椒為對(duì)照。

（4）乳酸菌發(fā)酵鲊廣椒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參考王玉榮的方法，并稍作修改。取鲊廣椒樣品50g添加150mL的去離子水在常溫下浸泡30min后12000r／min離心10min，取上清液備用。使用電子舌對(duì)鲊廣椒的酸、苦、澀、鮮和咸5個(gè)基本味，以及苦、澀和鮮3個(gè)基本味的回味進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)鲊廣椒樣品重復(fù)測(cè)4次，取后3次測(cè)試結(jié)果為原始數(shù)據(jù)，納入后續(xù)分析。在進(jìn)行樣品測(cè)試時(shí)，將對(duì)照組鲊廣椒樣品各滋味指標(biāo)的強(qiáng)度設(shè)置為0，添加乳酸菌制備的鲊廣椒樣品各滋味指標(biāo)的強(qiáng)度減去對(duì)照組相對(duì)應(yīng)指標(biāo)原始強(qiáng)度的值，即為該樣品滋味指標(biāo)的相對(duì)強(qiáng)度。

（5）乳酸菌發(fā)酵鲊廣椒氣味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參考王俊的方法，并稍作修改。取鲊廣椒樣品10g于樣品瓶中，室溫下平衡30min，使用電子鼻進(jìn)行典型類型物質(zhì)測(cè)定。進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，傳感器自動(dòng)清潔時(shí)間為95S，樣品測(cè)試時(shí)間為60S，每間隔一秒測(cè)定一個(gè)響應(yīng)值，選取測(cè)試時(shí)間為49S、50S和51S時(shí)10個(gè)金屬氧化電極對(duì)應(yīng)響應(yīng)值的平均值為原始數(shù)據(jù)，納入后續(xù)分析。

（6）統(tǒng)計(jì)分析

使用曼-惠特尼檢驗(yàn)對(duì)L.plantarum和腸球菌制備鲊廣椒各品質(zhì)指標(biāo)差異的顯著性進(jìn)行分析，使用主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和多元方差分析(multivariateanalysisofvariance，MANOVA)對(duì)L.plantarum和腸球菌制備鲊廣椒品味的差異性進(jìn)行分析。

使用BioEdit和MEGA7進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建；使用Matlab2010b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；使用origin8.5繪圖。

二、結(jié)果與分析

1、鲊廣椒中乳酸菌的分離鑒定

采用純培養(yǎng)技術(shù)，本研究從10個(gè)鲊廣椒樣品中共分離出22株疑似乳酸菌，其中13株為桿菌，9株為球菌，在對(duì)16SrRNA序列全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序的基礎(chǔ)上，其和模式菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由圖1可知，13株桿菌可分為4個(gè)種，其中HUBAS52151、HUBAS52153、HUBAS52154、HUBAS52155、HUBAS52158、HUBAS52166、HUBAS52168、HUBAS52173和HUBAS52175均鑒定為L(zhǎng)actobacillusplantarum(植物乳桿菌)，HUBAS52152鑒定為L(zhǎng)actobacillusfarcimin括(香腸乳桿菌)，HBUAS52156鑒定為L(zhǎng)actobacillusfutsaii(福菜乳桿菌)，HBUAS52167和HBUAS52174均鑒定為L(zhǎng)actobacillusfermentum(發(fā)酵乳桿菌)。由圖1亦可知，9株球菌可分為4個(gè)種，其中HBUAS52163和HBUAS52169鑒定為Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)，HBUAS52164鑒定為Weissellaparamesenteroides(類腸膜魏斯氏菌)，HBUAS52171和HBUAS52172鑒定為Enterococcusfaecalis(糞腸球菌)，HBUAS52165、HBUAS52170、HBUAS52l77和HBUAS52l78鑒定為Enterococcusfaecium(屎腸球菌)。荊州地區(qū)作廣椒中乳酸菌種群的構(gòu)成如圖2所示。

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