五味子屬木蘭科植物，其主要含有多糖類、木脂素類、三萜類、黃酮類以及揮發(fā)油等化合物。具有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心等作用。此外，五味子主要成分有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗菌、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗衰老等作用。

多糖是由單糖通過糖苷鍵聚合形成的生物大分子，廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物和藻類等，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種藥理活性；多糖傳統(tǒng)的提取方法是熱回流提取，存在能耗高、時(shí)間長、效率低等不足；現(xiàn)代提取工藝有超聲提取、微波提取、酶解提取等；提取工藝的研究是多糖研究的基礎(chǔ)，它不僅影響提取的效率，而且會(huì)影響多糖的活性。

采用均質(zhì)酶解提取法提取五味子多糖，與傳統(tǒng)浸提、回流等方法相比，均質(zhì)提取法具有提取時(shí)間短、效率高、操作簡便、等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)首次采用均質(zhì)酶解法提取五味子多糖，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝，為植物多糖的生產(chǎn)提供了一種高效、環(huán)境友好的方法，為五味子多糖在醫(yī)藥、健康食品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、儀器與材料

MH2000電子調(diào)溫電加熱套（北京化玻醫(yī)療器械有限公司），T10BS25分散機(jī)（德國IKA公司），F(xiàn)A16004N電子分析天平（上海箐海儀器有限公司），MULTIFUZESER高速離心機(jī)（ThermoFisher公司），RV10DS25旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司），1601紫外分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器公司），F(xiàn)D-1E-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DC-1000A高速多功能粉碎機(jī)（浙江省武義鼎藏日用金屬制品廠），SU8000掃描電鏡（日本日立）；五味子購于長春農(nóng)貿(mào)市場，果膠酶（500u/mg，上海騰躍生物技術(shù)有限公司），其他試劑均為分析純。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）五味子多糖的均質(zhì)酶解提取

將干燥后的五味子粉碎，依次用石油醚、90%的乙醇回流，除去色素、脂質(zhì)類物質(zhì)以及低聚糖和小分子物質(zhì)，蒸發(fā)溶劑，得到預(yù)處理樣品。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的五味子3.0g，用液料比為25mL/g的果膠酶水溶液浸泡12h，在選定的條件下提取，然后以轉(zhuǎn)速為3500r/min離心15min，上清液減壓濃縮至一定體積，用95%乙醇在4℃條件下醇沉12h，沉淀冷凍干燥得到粗多糖。提取后的殘?jiān)栏桑脪呙桦婄R觀察其組織破壞程度。

（2）五味子多糖的熱回流提取

取一定量的預(yù)處理樣品，按照100mL/g溶劑原料比加入蒸餾水，浸泡12h，在96℃溫度下回流提取4h，將干燥后的五味子粉碎，依次用石油醚、90%的乙醇回流，除去色素、脂質(zhì)類物質(zhì)以及低聚糖和小分子物質(zhì)，蒸發(fā)溶劑，得到預(yù)處理樣品。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的五味子3.0g，用液料比為25mL/g的果膠酶水溶液浸泡12h，在選定的條件下提取，然后以轉(zhuǎn)速為3500r/min離心15min，上清液減壓濃縮至一定體積，用95%乙醇在4℃條件下醇沉12h，沉淀冷凍干燥得到粗多糖。提取后的殘?jiān)栏?，用掃描電鏡觀察其組織破壞程度。得到回流提取粗多糖。提取后殘?jiān)栏桑脪呙桦婄R觀察。

（3）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加蒸餾水溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度0.1g/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于25mL具塞試管中，加水至2.0mL，加入1.0mL5%苯酚溶液，最后加5.0mL濃硫酸，靜置5min，然后在40℃水浴中加熱30min，以試劑空白溶液為參比，在490nm波長處測定吸光度（Abs），用Abs對(duì)濃度C（mg/mL）回歸，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線C=8.4939×Abs+0.152，其中R²=0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線如下如圖1。

計(jì)算公式如下：

多糖得率（%）=（V×C×F×W₂/W₃×W₁）×100；

式中：C-由回歸方程計(jì)算所得的多糖的濃度（g/L），V-溶解W₃定容后體積（L），F(xiàn)-換算因子；W₁-原樣質(zhì)量，W₂-由W₁提取的粗多糖的質(zhì)量（g），W₃-從W₂中稱取用于分析測定的粗多糖的質(zhì)量。

（4）單因素試驗(yàn)

固定其他條件，分別以加酶量（0.01、0.02、0.04、0.05g）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5min）、提取溫度（35、45、55、65、75℃）和均質(zhì)轉(zhuǎn)速（8000、11500、14500、17500、20500r/min）作為變量，考查各因素對(duì)多糖提取得率的影響。

(5)BBD試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析

選取提取溫度、提取時(shí)間和均質(zhì)轉(zhuǎn)速三個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素選取三個(gè)水平（表1），以多糖提取得率（Y%）為響應(yīng)值，采用BBD試驗(yàn)方案（表1）、響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)。利用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

二、結(jié)果與討論

1、單因素實(shí)驗(yàn)

（1）提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理樣品3.0g，以液料比25mL/g的1%果膠酶液浸泡6h，提取溫度45℃，均質(zhì)轉(zhuǎn)速14500r/min時(shí)，分別考察提取時(shí)間1、2、3、4、5min對(duì)提取得率的影響，結(jié)果見圖2（a）。由圖2（a）可知，在1～2min內(nèi)多糖提取得率隨時(shí)間的增加快速提高，2min時(shí)多糖提取得率達(dá)到最高值，之后隨時(shí)間的增加而降低。在1～2min時(shí)間范圍內(nèi)隨時(shí)間的增加，組織細(xì)胞的破碎程度增加，胞內(nèi)多糖的溶解、擴(kuò)散的效率提高，提取
得率快速增加，且高速的剪切作用下，多糖的溶解和擴(kuò)散均可在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，因此相對(duì)熱回流提取，均質(zhì)酶解提取需要的時(shí)間非常短；2min后，可能是多糖的糖苷鍵及果膠酶的結(jié)構(gòu)在強(qiáng)烈的剪切作用下被破壞，導(dǎo)致多糖提取得率減少。因此，提取的最佳時(shí)間范圍是1～3min。

（2）提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取3.0g預(yù)處理樣品，以液料比25mL/g的1%的果膠酶液浸泡6h，提取時(shí)間2min，均質(zhì)轉(zhuǎn)速14500r/min，分別考察溫度35、45、55、65、75℃對(duì)提取得率的影響，結(jié)果見圖2（b）。由圖2（b）可知，在35～45℃溫度范圍內(nèi)多糖提取得率隨溫度增加迅速增加，在45℃時(shí)提取得率達(dá)到最大值，之后隨溫度增加快速降低。分析可能的原因是在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高酶活性增加、多糖在水中的溶解度增大，多糖的溶解和擴(kuò)散速率增加，提取得率快速提高。而當(dāng)溫度增加超過一定范圍內(nèi)，隨溫度的增加，酶的活性降低，多糖的結(jié)構(gòu)也可能隨溫度增加而發(fā)生變化，致使提取得率下降。因此，選作45℃為單因素的最佳溫度。

（3）均質(zhì)轉(zhuǎn)速對(duì)多糖提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取3.0g預(yù)處理樣品，用液料比25mL/g的1%的果膠酶液浸泡6h，提取溫度45℃，提取時(shí)間2min時(shí)，考察均質(zhì)轉(zhuǎn)速分別為8000、11500、14500、17500、20500r/min時(shí)對(duì)提取得率的影響，結(jié)果見圖2（c）。由圖2（c）可以發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)轉(zhuǎn)速在8000～14500r/min范圍內(nèi)，多糖提取得率隨均質(zhì)轉(zhuǎn)速數(shù)的增加而增加，當(dāng)均質(zhì)轉(zhuǎn)速為14500r/min時(shí)提取率最大，之后多糖提取得率隨轉(zhuǎn)速的增加緩慢下降。這可能是均質(zhì)轉(zhuǎn)速數(shù)增加，對(duì)固體原料組織的破碎程度增加，單位質(zhì)量的固體組織的比表面積增加，溶劑與樣品的接觸更充分，多糖由組織內(nèi)部向周圍溶劑的擴(kuò)散速率加快，多糖的提取得率增加；均質(zhì)轉(zhuǎn)速數(shù)較大時(shí)，多糖以及酶的結(jié)構(gòu)可能被破壞，致使多糖提取得率出現(xiàn)緩慢降低。因此，最佳的均質(zhì)轉(zhuǎn)速為14500r/min。

（4）果膠酶用量對(duì)五味子多糖提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取3.0g五味子，用液料比為25mL/g的不同濃度的果膠酶液浸泡6h，在提取溫度45℃，提取時(shí)間為2min，均質(zhì)轉(zhuǎn)速14500r/min，分別考察果膠酶用量0.010、0.020、0.030、0.040、0.050g對(duì)五味子多糖提取得率的影響，結(jié)果見圖2（d）。由圖2（d）可知，在0.01～0.04g加酶量范圍內(nèi)，多糖提取得率隨果膠酶加入量的增加提取得率由5.6%緩慢增加到6.6%，這可能是由于果膠酶量增加，酶解效果增加，提取得率增加；在加酶量為0.04g（1.33%）時(shí)，多糖提取得率達(dá)到最高，之后隨果膠酶量的增加而下降。加酶量過多時(shí)，可能會(huì)使多糖在果膠酶和強(qiáng)烈的剪切作用下，多糖被降解，使提取得率降低。但相對(duì)其他3個(gè)影響因素，加酶量對(duì)多糖得率影響相對(duì)較小，但加酶量對(duì)提取成本的影響較大。因此果膠酶的最佳加酶量為1.33%，且不再進(jìn)一步優(yōu)化。

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