二、通過基因突變改善

SOD的性能hCu/Zn-SOD作為抗氧化酶能夠減輕活性氧自由基對細胞的損傷，且不會引起免疫反應(yīng)，但是hCu/Zn-SOD的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床使用受到產(chǎn)量和可溶性的限制。通過定點突變改變hCu/Zn-SOD的一些氨基酸殘基可以改善其產(chǎn)量和品質(zhì)。

hCu/Zn-SOD包含2個亞基，每個亞基又包含4個半胱氨酸（Cys）殘基，其對應(yīng)的位置分別是6、57、111和146，其中Cys57和Cys146之間形成分子內(nèi)二硫鍵，6位和111位是游離的半胱氨酸殘基。周贊虎等應(yīng)用PCR定點突變技術(shù)把hCu/Zn-SOD基因的Cys111密碼子突變?yōu)锳la111密碼子，通過隨機同源重組將突變后的hCu/Zn-SOD整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942中并實現(xiàn)表達，表達產(chǎn)物在80℃保溫30min后仍具有95%的活力，耐熱能力比天然hCu/Zn-SOD有了較大的提高。張琨等通過重疊PCR技術(shù)將天然hCu/Zn-SOD基因的Cys6密碼子突變?yōu)锳la6密碼子，Cys111密碼子突變?yōu)镾er111密碼子，通過大腸桿菌重組表達得到改構(gòu)體蛋白rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，從1g濕菌體中獲得的活性蛋白總量高于未改構(gòu)體的2倍，改構(gòu)體的熱穩(wěn)定性也獲得大幅度提高。高淑彬分別構(gòu)建天然hCu/Zn-SOD和Cys111突變成Ala111的突變hCu/Zn-SOD表達載體，并在大腸桿菌中表達，其表達量都占菌體總蛋白的45%以上，突變hCu/Zn-SOD酶活力和穩(wěn)定性均高于天然hCu/Zn-SOD，證明通過基因突變可以改善酶的性能。通過隨機整合方式將突變的hCu/Zn-SOD基因整合到藍藻Synechoccussp.PCC7942染色體上，動物實驗證明轉(zhuǎn)突變hCu/Zn-SOD基因的藍藻口服后具有較強的抗氧化作用，為進一步研究開發(fā)半衰期長的可直接口服的hCu/Zn-SOD奠定了基礎(chǔ)。Zhang等將hCu/Zn-SOD的6位和111位的半胱氨酸（C）突變?yōu)榻z氨酸（S），構(gòu)建了3個突變體mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S和mhSOD1/C6S/C111S。結(jié)果表明，與野生型相比，除了C6S突變使重組蛋白可溶性表達降低以外，C111S和C6S/C111S突變均能增加重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，進而提高重組蛋白的產(chǎn)量，且C111S突變效果優(yōu)于C6S/C111S。此外，mhSOD1/C111S顯示了更低的毒性和更強的美白和抗輻射活性。因此，C111S突變是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)重組人源SOD的一個有效策略。

三、通過融合蛋白技術(shù)改善

SOD的性能融合蛋白技術(shù)是指利用基因工程技術(shù)，將兩段或多段編碼功能蛋白的基因有目的地連接在一起并進行表達，從而產(chǎn)生一種新的人工融合蛋白的方法。由相對較小的結(jié)構(gòu)域拼裝成較大的多功能蛋白是自然進化的一個重要因素。因此，在基因水平上將不同的結(jié)構(gòu)域進行連接，并且使其表達成融合蛋白，是形成多功能蛋白、降低原蛋白毒副作用及改造天然蛋白的重要方法。由于有新功能蛋白加入，融合蛋白的性能被優(yōu)化，并產(chǎn)生新的生物功能和活性，所以這種新型的人工蛋白具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。

1、PTD-SOD融合蛋白

細胞膜上沒有專一的SOD通道或受體，外源SOD難以進入細胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，因而限制了其臨床應(yīng)用。HIV-1反式激活蛋白TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是一種廣譜的能攜帶大分子物質(zhì)穿透動物細胞膜的小分子多肽，可以解決SOD蛋白透膜相關(guān)難題。PTD可以引導(dǎo)多種多肽和蛋白進入目標細胞，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快、效率高和溫度適應(yīng)性廣等優(yōu)點，且能夠透過血腦屏障。大部分PTD或與PTD共價結(jié)合的蛋白在跨過細胞膜后轉(zhuǎn)運到細胞核而不是細胞質(zhì)或其他細胞器，因此PTD運輸系統(tǒng)只適用于在細胞核內(nèi)發(fā)揮功能的藥物分子的轉(zhuǎn)運。王宇等研究PTD4介導(dǎo)的Cu/Zn-SOD對大鼠心肌細胞缺氧-復(fù)氧損傷（HRI）的影響，發(fā)現(xiàn)重組的PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白可以明顯減少HRI導(dǎo)致的細胞凋亡，從而減輕大鼠心肌細胞的HRI，證明了重組PTD4-Cu/Zn-SOD可以高效穿透心肌細胞，改善心肌細胞缺血再灌注損傷。Yao等在骨癌研究中發(fā)現(xiàn)，活性氧在一定程度上參與了腫瘤疼痛的發(fā)展和持續(xù)，而重組PTD-Cu/Zn-SOD可以減弱這種作用，因此其在骨癌治療中可作為一種潛在的輔助治療劑。Zhang等將所獲得的Mn-SOD、PTD-Mn-SOD和脂質(zhì)體Mn-SOD用于保護人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）氧化損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與天然Mn-SOD相比，PTD-Mn-SOD和脂質(zhì)體Mn-SOD可發(fā)揮更強的藥理作用。孟麗華和薛榮亮通過檢測PTD4-Cu/Zn-SOD進入人星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的熒光蛋白的分布情況，發(fā)現(xiàn)PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白能夠穿過細胞膜，且可以降低因細胞缺氧損傷所致的細胞凋亡。PTD與SOD進行融合的方法簡單易行，可提供大量廉價、安全、高活性的重組SOD制品。需要強調(diào)的是，盡管PTD-Cu/Zn-SOD融合蛋白具有良好的穿透細胞膜特性，但沒有組織特異性，若是靜脈給藥可能會迅速導(dǎo)入血管內(nèi)皮細胞或血細胞，不能很好地到達靶區(qū)發(fā)揮作用，因此需要進一步改進結(jié)構(gòu)或給藥途徑以解決其靶向問題。

2、PEP-SOD融合蛋白

PEP-1是一種人工設(shè)計的主要用于轉(zhuǎn)導(dǎo)大分子蛋白的細胞穿透肽，它能高效率地攜帶具有治療效果的蛋白進入細胞并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Liu等構(gòu)建了表達PEP-1-hMnSOD融合蛋白的表達載體，并在雙歧桿菌中成功表達了PEP-1-hMnSOD融合蛋白。在進一步臨床研究中，將透膜性和穩(wěn)定性較差的hMnSOD通過PEP-1遞送到結(jié)腸炎癥細胞內(nèi)，通過對炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平以及結(jié)腸組織學(xué)損傷檢測，發(fā)現(xiàn)PEP-1-hMnSOD融合蛋白能夠有效地減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。因此口服表達PEP-1-hMnSOD融合蛋白的雙歧桿菌工程菌可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的新方法。

神經(jīng)干細胞移植已被證明是一種潛在的治療創(chuàng)傷性腦損傷的策略。Jia等探索NSCs移植配合PEP-1-SOD1共同治療大鼠腦缺血的可能性。體外實驗證明，PEP-1-SOD1能提高神經(jīng)干細胞的增殖和分化；體內(nèi)實驗表明，與單獨NSCs移植相比，PEP-1-SOD1聯(lián)合NSCs移植策略對大鼠TBI后的功能恢復(fù)有明顯的促進作用。Yoo等探討了Cu/Zn-SOD對脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞抗脊髓缺血損傷的促進作用。結(jié)果顯示PEP-1-SOD1和Ad-MSCs聯(lián)合應(yīng)用進一步增強了Ad-MSCs對神經(jīng)元缺血損傷的保護作用。相對于PTD融合蛋白，PEP融合蛋白具有其獨特優(yōu)勢。PTD融合蛋白進入細胞后，所攜帶的功能蛋白需要在細胞內(nèi)分子伴侶HSP90的幫助下重折疊才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，靶蛋白的生物活性依賴于細胞內(nèi)HSP90的重折疊效率，因此PTD融合蛋白技術(shù)的臨床應(yīng)用受到了一定限制。而PEP融合蛋白能夠直接攜帶具有生物活性的功能蛋白進入細胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，同時它還具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、無毒性及不受血清影響等優(yōu)勢，這使細胞穿透肽PEP在應(yīng)用上更具有潛力，可能成為更適合于蛋白治療的載體工具。

3、多功能融合蛋白

研究者們曾嘗試將不同功能的蛋白與SOD進行組合，將不同蛋白的優(yōu)勢和特點融合在一起，以賦予目的蛋白多種新的屬性和功能。周宇飛等為了增強胸腺素α1（Thyα1）的穩(wěn)定性和免疫功能，采用胸腺素α1與人源SOD融合的策略，構(gòu)建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1兩個融合基因，并在畢赤酵母中實現(xiàn)了高水平表達。重組表達的融合蛋白經(jīng)過進一步純化后進行了活性檢測，結(jié)果表明這兩個融合蛋白既有SOD的活性，又有Thyα1的活性。盛明明等采用基因工程技術(shù)通過大腸桿菌制備一種兼具人源SOD和過氧化氫酶（CAT）活性的多功能融合蛋白CAT-PTD-SOD，該融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在。在0.033mol/L、甚至0.067mol/L的H2O2溶液中，SOD活性在20min內(nèi)無明顯下降，證明其具備抗氧化和分解過氧化氫的雙重作用。潘劍茹等構(gòu)建了SOD1和穿膜肽R9的融合蛋白表達質(zhì)粒GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）-SOD1-R9，通過大腸桿菌BL21（DE3）表達出具有雙效抗氧化功能的GST-SOD1-R9融合蛋白。該融合蛋白不僅能夠清除多余的活性氧自由基，而且還能夠修復(fù)或清除體內(nèi)已被氧化損傷的生物分子，并再生氧化損傷的含巰基蛋白。Pan等研究了GST-TAT-SOD對順鉑損傷細胞的保護作用，證明GST-TAT-SOD通過直接清除多余的細胞內(nèi)自由基和增強細胞抗氧化防御，可以解除順鉑治療引起的生長抑制和細胞凋亡，因此GST-TAT-SOD可以作為順鉑誘導(dǎo)的細胞損傷的保護劑。此外，Pan等還通過小鼠全身X射線輻射實驗，表明雙功能GST-TAT-SOD對X射線輻射所致?lián)p傷有一定的防護作用，能夠有效提高小鼠脾臟和肝臟的抗氧化能力、脾臟白髓數(shù)目和胸腺指數(shù)等，不僅顯著提高了X射線輻照小鼠體重增長率，而且提高了接受致死量照射小鼠的存活率。GST-TAT-SOD的整體效果比阿米福汀好一些，所以GST-TAT-SOD可作為一種安全的輻射防護劑。

Luangwattananun等設(shè)計并研制了三功能融合蛋白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），與其之前設(shè)計的6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）相比，分子大小減小42%，其SOD和CAT活性分別提高22%和99%。在70℃孵育10min后，CS/S-TAT保留了54%的殘余SOD活性，而M-TAT/CM的SOD活性完全消除。此外，在70℃時，CS/S-TAT的半衰期比M-TAT/CM提高了5倍。該酶能夠跨膜進入哺乳動物細胞，可作為氧化損傷細胞的保護劑或治療劑。因此，這項工作為設(shè)計和合成一種更穩(wěn)定的多功能抗氧化酶提供了參考?？傊?，多功能的融合蛋白在抗氧化方面，往往比單一的抗氧化蛋白具有更大的優(yōu)勢。因此，融合蛋白的巨大優(yōu)勢使其有望成為新一代抗氧化藥物的有力競爭者，為開發(fā)高效率抗氧化蛋白開辟了新途徑。

四、總結(jié)與展望

SOD是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，具有重要的生物學(xué)功能。許多疾?。ㄈ缂∥s側(cè)索硬化、動脈硬化閉塞癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和感染性疾病等）的產(chǎn)生和發(fā)展與SOD缺乏或不正確折疊有關(guān)。隨著SOD研究不斷深入和工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴大，SOD還被應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、食品科學(xué)和植物病害預(yù)防等多個領(lǐng)域。但是受天然SOD的理化性質(zhì)所限，如靜脈注射后體內(nèi)半衰期僅為6min，口服后在胃腸道中容易被破壞而失去療效，膜透過率低等，這些因素使其在應(yīng)用方面受到了很大的限制。目前，人們對SOD蛋白進行了化學(xué)修飾、人工有機合成SOD模擬物和運用基因工程法制備SOD等方面的探索，普遍認為通過基因工程制備重組人源SOD是最為經(jīng)濟、快捷、有效且安全的方法。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外在微生物發(fā)酵生產(chǎn)重組SOD的菌種選育、高產(chǎn)菌開發(fā)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面都取得了一定進展。通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人源SOD，既降低了其他來源SOD的免疫原性問題，又解決了人源SOD的來源問題，并且可以克服傳統(tǒng)工藝限制，使人們可以按照自己的意愿定向改造目的蛋白。隨著研究的進一步深入，基于基因工程主導(dǎo)的生物工程將逐漸推進重組SOD實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，利用SOD開發(fā)的產(chǎn)品也將會得到更為廣泛的應(yīng)用。

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