超氧化物歧化酶是動(dòng)物、植物和微生物中普遍存在的一類酶，是生物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，也是體內(nèi)唯一能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶。SOD為金屬酶，按其結(jié)合的金屬離子種類不同，目前已知的SOD主要分為三類，即Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）和Fe-SOD（SOD3）。人體內(nèi)外源化合物在各種酶的作用下會(huì)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基在SOD的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）會(huì)立即將其分解為完全無害的水（圖1）。當(dāng)生物體沒有足夠多的SOD時(shí)，活性氧將會(huì)大量累積，如不能及時(shí)清除就會(huì)引發(fā)氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體損害，比如堿基突變、DNA鏈斷裂、膜脂過氧化和蛋白質(zhì)損傷等，從而加速衰老或?qū)е录膊?。除了抗氧化作用外，SOD還具有抗炎、抗腫瘤及調(diào)控免疫等重要作用，并且在免疫防御中起殺死病毒的作用。SOD具有廣泛的醫(yī)療價(jià)值，臨床上可用SOD治療和預(yù)防急性炎癥和水腫、氧中毒、肺氣腫、輻射病、老年性白內(nèi)障及衰老等。此外，SOD還可以作為食品和化妝品的添加劑。

國(guó)外主要從牛羊等動(dòng)物的血液中提取SOD，國(guó)內(nèi)主要從豬的血液中提取SOD。動(dòng)物來源的SOD存在與人交叉感染、過敏性反應(yīng)等不良現(xiàn)象。此外，因?yàn)榀偱２〉戎虏∫蜃拥膫鞑ィ瑥膭?dòng)物血液中提取SOD的安全性受到嚴(yán)重質(zhì)疑。歐盟于1999年已禁止將動(dòng)物來源的SOD用于人類醫(yī)療和保健。但因?yàn)閺膭?dòng)物血液中提取SOD成本低、工藝簡(jiǎn)單，至今無法全面禁止。天然SOD在應(yīng)用方面有其局限性：①半衰期短（5～10min），代謝迅速；②異源性—由于天然SOD的制劑多來源于動(dòng)物或微生物，對(duì)人體來說存在免疫原性問題；③不易透皮或透膜，吸收困難。天然SOD屬于大分子蛋白，在細(xì)胞膜上沒有專一受體，難以迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。多年來人們一直不斷嘗試各種方法來獲取SOD并改造其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而拓展其應(yīng)用范圍。常用的方法有化學(xué)修飾法、SOD模擬化合物和基因工程法等，其中通過基因工程技術(shù)獲取和改造SOD的相關(guān)研究發(fā)展尤為迅速。1983年，Sherman等首次克隆得到人源Cu/Zn-SOD（hCu/Zn-SOD）的cDNA序列，為通過基因工程獲取和改造SOD奠定了基礎(chǔ)。近年來，科學(xué)家們通過基因工程技術(shù)，并結(jié)合細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和微生物工程等技術(shù)，大大推動(dòng)了重組SOD在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，基因工程在工業(yè)化生產(chǎn)SOD中的地位愈發(fā)重要，與化學(xué)修飾法和SOD模擬化合物方法相比，基因工程廣開酶源，潛力巨大，是降低SOD生產(chǎn)成本和獲得無抗原性人源SOD的有效途徑。

目前，關(guān)于SOD的綜述有很多，研究者們分別從SOD的來源、分類、功能和催化機(jī)理等方面進(jìn)行了總結(jié)，并列舉了SOD在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品和食品開發(fā)等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景。本文重點(diǎn)綜述了重組人源SOD的研究策略與進(jìn)展，以期為SOD的理論研究與實(shí)際應(yīng)用提供參考。

一、表達(dá)系統(tǒng)的選擇

選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)是決定重組人源SOD高效表達(dá)的重要因素（表1）。在選擇蛋白表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，需要考慮的主要因素是蛋白活性、可溶性、得率及培養(yǎng)周期等。

1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早開展研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它也是目前最成熟的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達(dá)量高、繁殖快、成本低、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)和產(chǎn)物容易純化等優(yōu)點(diǎn)。張弘浩等將人源SOD基因?qū)氪竽c桿菌，得到包涵體形式的重組蛋白，經(jīng)過尿素處理、透析，重組蛋白由包涵體轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白。研究指出Cu²⁺、Zn²⁺的加入對(duì)于恢復(fù)SOD的活性和穩(wěn)定性是必不可少的，且適當(dāng)提高溫度將大大縮短復(fù)性時(shí)間，獲得的重組人源SOD比活力可達(dá)到6000U/mg以上。Zhu等克隆了人源胞外超氧化物歧化酶的cDNA，并在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá)，得到包涵體形式的重組蛋白。通過尿素處理獲得可溶性蛋白，并通過固定化金屬親和層析柱對(duì)重組hEC-SOD進(jìn)行逐步復(fù)性，得到了正確折疊的二聚體蛋白和單體蛋白，兩種蛋白的比活力分別為3475U/mg和510U/mg，二聚體的活性明顯高于單體。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但存在蛋白不能正確折疊、易形成包涵體、密碼子體系與真核生物差別較大、翻譯后修飾不完善和內(nèi)毒素等應(yīng)用瓶頸。

2、酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母表達(dá)系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白，并具有翻譯后修飾功能，兼具原核與真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，因此在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。其中甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，并以畢赤酵母應(yīng)用最多。釀酒酵母分泌外源蛋白效率低，且大規(guī)模發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的乙醇會(huì)影響菌體自身生長(zhǎng)，因此難以進(jìn)行高密度發(fā)酵。林士森等將hEC-SOD在畢赤酵母中表達(dá)，從上清液中獲得重組蛋白，經(jīng)純化后測(cè)得重組蛋白的比活力為1700U/mg。鄭屹峰等以表達(dá)hCu/Zn-SOD的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，采用甲醇-甘油混合飼喂的方法進(jìn)行5L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最終獲得的重組hCu/Zn-SOD比活力達(dá)到13539U/ml。畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)的重組蛋白能夠直接分泌至胞外，故有利于工業(yè)化分離與純化，其表達(dá)的蛋白能夠形成二硫鍵、進(jìn)行糖基化修飾等，且表達(dá)量高。然而，畢赤酵母表達(dá)體系不足之處在于使用甲醇作為誘導(dǎo)劑，具有一定危害，且糖基化與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有所不同。

3、植物表達(dá)系統(tǒng)

植物表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)來自病毒、細(xì)菌和動(dòng)物等的蛋白，易于大規(guī)模培養(yǎng)與生產(chǎn)，在基因表達(dá)及修飾方面也有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前已在煙草、水稻、紅花和馬鈴薯等植物中實(shí)現(xiàn)了許多外源蛋白的表達(dá)。由于煙草具有生物產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單、不進(jìn)入食物鏈及生物安全風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢(shì)，因此成為目前發(fā)展最成熟的植物表達(dá)體系。Park等通過植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草葉細(xì)胞中表達(dá)出具有催化活性的重組hEC-SOD，為植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組SOD開啟了新的大門。但由于利用植物表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白相關(guān)技術(shù)起步較晚，部分技術(shù)并非特別成熟，因此目前利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)目的蛋白與其他系統(tǒng)相比尚不具備競(jìng)爭(zhēng)力。

3、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

20世紀(jì)80年代起，以桿狀病毒為載體的外源基因表達(dá)體系日趨成熟，極大促進(jìn)了昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)既能表達(dá)原核基因也能表達(dá)真核基因，并兼具了原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量高和真核表達(dá)系統(tǒng)蛋白翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)。昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體采用了昆蟲核型多角體病毒中多角體蛋白基因的強(qiáng)啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)很多真核蛋白的有效表達(dá)。常用的宿主細(xì)胞則來源于草地貪夜蛾的Sf-9和Sf-21細(xì)胞系。范立強(qiáng)等將hEC-SOD基因插入昆蟲桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBacHTb中，再將其轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4，SDS-PAGE和Westernblot結(jié)果顯示hEC-SOD在粉紋夜蛾細(xì)胞中成功表達(dá)，其細(xì)胞裂解物中的hEC-SOD比活力為260U/mg。Shrestha等將全長(zhǎng)和截短的hEC-SOD基因分別克隆到供體質(zhì)粒pFastBacHTb，并轉(zhuǎn)染到SF9桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，也成功表達(dá)出了有活性的全長(zhǎng)和截短的hEC-SOD，且Westernblot顯示重組hEC-SOD同時(shí)以單體（33kD）和二聚體（66kD）形式存在。

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以同時(shí)表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因，在生產(chǎn)蛋白復(fù)合體時(shí)尤其有效。目前，昆蟲表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和重組病毒殺蟲劑等眾多領(lǐng)域。但由于鱗翅類昆蟲的蛋白加工路徑和高等真核生物不同，且桿狀病毒感染可能對(duì)宿主的蛋白加工具有負(fù)面影響，因此其應(yīng)用還存在一定的限制。

5、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

一般通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒載體感染的方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。利用病毒表達(dá)體系可以快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，而利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞則需要幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間。Lu等采用編碼hCu/Zn-SOD和hEC-SOD的兩個(gè)序列，以及山羊β-酪蛋白的5'端和3'端的調(diào)控元件，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體，通過共轉(zhuǎn)染法制備山羊胚胎成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)顯示重組hCu/Zn-SOD和hEC-SOD在轉(zhuǎn)雙基因山羊乳腺中均有表達(dá)。聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顯示，重組hCu/Zn-SOD的表達(dá)量為100.14mg/L，重組hEC-SOD的表達(dá)量為279.10mg/L。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，羊奶中重組hCu/Zn-SOD和hEC-SOD的總生物活性為1451U/ml。這些結(jié)果證明了哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有生產(chǎn)重組SOD的潛力。

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