2、響應(yīng)面優(yōu)化

（1）BBD試驗方案及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定果膠酶加酶量1.33%，溶劑原料比25mL/g，選取提取溫度（A）、均質(zhì)轉(zhuǎn)速（B）和提取時間（C）這三個顯著因素為考察變量素，每個因素取三個水平，進(jìn)行BBD試驗，以多糖提取得率（Y%）為響應(yīng)值，對提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。依據(jù)BBD實驗結(jié)果，用Design-Expert.8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以多糖提取率為響應(yīng)值分別對各因素進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到回歸模型為：Y=10.53+0.53A+0.37B+0.11C-0.026AB-0.67AC-1.20BC-4.32A²-3.20B²-2.20C²；采用F檢驗進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。由表2可知，回歸模型顯著水平P＜0.0001，表明回歸模型顯著準(zhǔn)確，模型確定系數(shù)R²=0.9829，表明效應(yīng)值的變化有98.29%以上是來自自選變量，本試驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際測量值具有高度的相關(guān)性，該模型的失擬度沒有顯著性差異，表明回歸方程能較好地模擬真實曲面，檢驗方法可行。

本實驗回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)R²_Adj=0.9609，說明該模型能解釋96.09%試驗數(shù)據(jù)的變異性。此數(shù)據(jù)表明，該模型擬合程度良好，試驗誤差相對較小。失擬項P=0.1121＞0.05，該實驗變異系數(shù)C.V.%=10.87，據(jù)此證明可用該模型方程分析和預(yù)測不同提取條件下五味子多糖得率。由表2可知A因素對五味子多糖得率有極顯著影響，B因素影響非常顯著，其次是C因素影響，影響順序為：A＞B＞C。

（2）響應(yīng)面分析及工藝優(yōu)化

利用Box-Behnken軟件，根據(jù)建立的回歸方程作出3D響應(yīng)面圖（圖3）。從圖3的3D圖中分析可知，兩因素對提取得率的交互作用由大到小依次為閃提速率和提取溫度＞提取時間和提取溫度＞閃提轉(zhuǎn)速和提取時間。

固定提取時間2min，提取溫度和均質(zhì)轉(zhuǎn)速對多糖提取得率的交互影響如圖3（a）所示，在8500～15280r/min和35.00～48.52℃范圍內(nèi)均質(zhì)轉(zhuǎn)速增加和提取溫度升高提取得率增加，之后隨均質(zhì)轉(zhuǎn)速和溫度的增加提取得率快速降低，說明在一定的范圍內(nèi)增加均質(zhì)轉(zhuǎn)速、升高提取溫度，有利于組織細(xì)胞的破碎、多糖的溶解和擴(kuò)散，提取得率增加；從3D圖可以發(fā)現(xiàn)均質(zhì)轉(zhuǎn)速和提取溫度對提取得率的影響程度接近；但是過高的提取溫度和均質(zhì)轉(zhuǎn)速可能會造成多糖降解、結(jié)構(gòu)被破壞，使得提取得率下降。

當(dāng)均質(zhì)轉(zhuǎn)速一定時，提取溫度和提取時間對多糖提取得率的交互影響如圖3（b），在1.00～2.05min和35.00～47.66℃范圍內(nèi)隨提取時間和提取溫度的增加多糖提取得率增大，超過這一范圍延長提取時間和升高提取溫度多糖提取得率逐漸下降，提取溫度對得率的影響程度明顯高于提取時間的影響，主要原因可能是提取溫度既影響多糖的溶解、擴(kuò)散，又會影響到酶的活性，而在高速剪切作用下提取時間對多糖的溶解和擴(kuò)散的影響是有限的。

當(dāng)提取溫度一定時，提取時間和均質(zhì)轉(zhuǎn)速對多糖提取得率的交互影響如圖3（c）所示，由圖可以發(fā)現(xiàn)較高的均質(zhì)轉(zhuǎn)速和較長的提取時間有利于多糖的提取，但閃提轉(zhuǎn)速對多糖提取得率的影響程度明顯高于提取時間的影響；說明在一定的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，增加均質(zhì)轉(zhuǎn)速組織細(xì)胞的破碎程度更加徹底，利于多糖的溶解、傳質(zhì)，提取得率快速增加；超過一定范圍增加均質(zhì)轉(zhuǎn)速和時間可能會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞致使多糖提取得率降低。

通過根據(jù)Box-Behnken軟件對試驗結(jié)果和響應(yīng)面分析，獲得均質(zhì)酶解提取五味子多糖的最佳工藝條件為：提取時間1.92min、提取溫度50.82℃、均質(zhì)轉(zhuǎn)速16319.73r/min。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行提取實驗，五味子多糖的預(yù)測提取得率為9.39%。選取果膠酶量1.33%、提取時間2min、提取溫度51℃、均質(zhì)轉(zhuǎn)速16320r/min為實驗條件，提取3次，計算多糖的平均提取得率為10.03%，與模型預(yù)測得率9.39%接近，說明建立的模型準(zhǔn)確、可靠，可以用來預(yù)測五味子多糖的提取得率。

3、不同提取工藝提提取效率的比較

分別取3g預(yù)處理樣品，用均質(zhì)酶解和熱回流提取五味子粗多糖，均質(zhì)酶解提取得率為10.01%，熱回流粗多糖提取得率為7.13%，均質(zhì)酶解提取的提取得率提高40.39%；均質(zhì)酶解提取時間2min，熱回流提取時間是240min，時間降低了99.17%。為了比較2種提取工藝的提取效率，對熱回流提取和均質(zhì)酶解提取后的樣品組織采用掃描電鏡進(jìn)行了觀察，圖4（a）為熱回流提取后的五味子樣品組織的微觀結(jié)構(gòu)，圖4（b）為均質(zhì)酶解提取后的樣品的微觀結(jié)構(gòu)。從掃描電鏡圖可觀察到熱回流4h后的五味子樣品放大600倍時，五味子細(xì)胞組織的微觀結(jié)構(gòu)相對比較完整，而將均質(zhì)酶解提取后的樣品放大400倍，觀察到細(xì)胞組織的微觀結(jié)構(gòu)有較大程度的破碎，這是在分散機(jī)的強(qiáng)剪切和酶解的共同作用下細(xì)胞組織有較大程度的破碎，便于多糖的快速溶解、擴(kuò)散，提取得率大幅提高、時間極短、能耗降低。因此均質(zhì)酶解為植物活性多糖的提取提供了一種高效的綠色提取技術(shù)。
 

三、結(jié)論

通過單因素試驗考察了各因素對多糖提取得率的影響次序和水平，固定果膠酶濃度為1.33%，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了五味子多糖的最佳均質(zhì)酶解提取工藝參數(shù)：提取時間1.92min，提取溫50.82℃，均質(zhì)轉(zhuǎn)速16319.73r/min，該條件下多糖提取得率為10.01%，與模型預(yù)測值9.39%接近，說明建立的模型準(zhǔn)確、可靠。本實驗所采用的均質(zhì)酶解法不僅時間短、提取率較高，而且操作方法簡單，為植物活性多糖的提取提供一種高效的、綠色提取技術(shù)。

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