藜麥，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)的一種偽谷物，一年生，葉子較寬，自花授粉。藜麥具有耐寒、耐旱、耐鹽堿和生長(zhǎng)在貧瘠土壤的能力。藜麥不含麩質(zhì)，是素食主義者的理想食品。藜麥?zhǔn)且环N全蛋白食品，蛋白質(zhì)含量高達(dá)12％～23％，且氨基酸含量豐富，其中賴氨酸含量是普通谷物的2倍，氨基酸組成接近FAO推薦的理想蛋白比例，是一種很好的植物蛋白來源。

藜麥富含淀粉、脂肪、膳食纖維和多種營(yíng)養(yǎng)元素，有著“營(yíng)養(yǎng)黃金”之稱。藜麥及其種子可用于啤酒釀造，藜麥芽可加入沙拉中食用，此外，藜麥還可用于味噌、醬粉、黃酒、飲料、餅干、面包等調(diào)味品和食品的制作。藜麥具有多種化學(xué)成分，包括皂素、植物甾醇、植物蛻皮激素、酚類物質(zhì)和生物活性肽。因此，藜麥?zhǔn)且环N功能性食品。

是一種功能性食品。研究表明，藜麥多肽液具有抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性、降血糖等作用。目前，對(duì)藜麥的相關(guān)研究主要集中在黃酮、多酚、蛋白等提取分離和相關(guān)活性研究上，酶解藜麥蛋白制備功能活性肽的報(bào)道較少，VilcacundoR等模擬人體胃腸環(huán)境消化藜麥蛋白，分離出具有抑制二肽酶IV、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶活性肽鏈。田旭靜等以風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶為1:1酶解藜麥糠蛋白制備抗氧化肽，其活性與劑量呈量效關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)利用藜麥為材料，提取蛋白進(jìn)行酶解，以酶解后的多肽液對(duì)α-淀粉酶的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶，通過酶解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得最佳酶解工藝條件，為藜麥的相關(guān)研究和保健酒類飲料的開發(fā)及應(yīng)用提供了參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

藜麥：粉碎過60目篩脫脂、烘干，山西稼祺藜麥開發(fā)有限公司；牛血清蛋白：武漢華順試劑耗材有限公司；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、可溶性淀粉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶(100U／mg)、堿性蛋白酶(200U／mg)、風(fēng)味蛋白酶(20u／mg)、胰蛋白酶(250u／mg)、α-淀粉酶(2×10⁴U／mL，用pH6.9的磷酸鹽緩沖溶液配成10u／mL使用)：上海源葉生物科技有限公司。

2、儀器與設(shè)備

AR313電子天平、FE20pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HK-04A粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；Multifugex1R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(上海)有限公司；UV-1000分光光度計(jì)，日本島津科技有限公司；85-2型磁力攪拌機(jī)，上海司樂儀器有限公司。

3、方法

（1）藜麥蛋白酶解工藝

稱取一定量粉碎脫脂后的藜麥粉，采用堿溶酸沉法提取藜麥粗蛋白，將提取的粗蛋白樣品配制成1％質(zhì)量濃度的蛋白液，分別用不同的蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解完后沸水浴滅酶10min，冷卻，以8000r／min離心10min，收集上清液測(cè)其多肽含量，比較不同酶解條件制備的酶解液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，以研究藜麥多肽制備的酶解工藝。

（2）檢測(cè)方法

①多肽含量及得率測(cè)定

采用雙縮脲法繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
多肽液樣品多肽含量的檢測(cè)：取3mL樣品溶液加入3mL15％(W／V)的三氯乙酸(TCA)水溶液于漩渦混合儀上混合均勻，然后在10000r／min下離心10min，取上清液于540nm下測(cè)定OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(g／L)，進(jìn)而可求得樣品中的多肽含量。

②藜麥多肽液對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的測(cè)定

樣品管：取0.5mL離心后的多肽液和等量的10U／mLα-淀粉酶溶液于37℃加熱10min，然后加入2％可溶性淀粉1mL，反應(yīng)5min，加入DNS試劑1mL，沸水浴5min冷卻，稀釋至25mL，于520nm測(cè)定吸光度OD。對(duì)照管：用蒸餾水代替多肽液，記作OD^，，以蒸餾水代替淀粉液作空白，記作OD”。

（3）藜麥蛋白酶解工藝優(yōu)化

①蛋白酶的篩選

選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶4種蛋白酶分別進(jìn)行初步水解。水解條件：藜麥蛋白質(zhì)量濃度1％，加酶量0.3×10⁴U／g，在不同蛋白酶各自最適pH和溫度條件下酶解(見表1)，酶解時(shí)間為60min，以多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出多肽得率高且活性抑制率高的蛋白酶，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

②藜麥蛋白酶解單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)問對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50mL的水配制成1％的蛋白溶液，在pH8.0、溫度50℃、加酶量0.3×10⁴U／g的條件下分別酶解1，1．5，2，2．5，3h。

酶解溫度對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50mL的水配制成1％的蛋白溶液，在溫度30，40，50，60，70℃、pH8．0、加酶量0.3×10⁴U／g的條件下酶解2h。

pH對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50mL的水配制成1％的蛋白溶液，設(shè)定酶解溫度50℃，加酶量0.3×10⁴U／g，分別在pH6，7，8，9，10的條件下酶解2h。

加酶量對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5g藜麥粗蛋白粉5份，加入50mL的水配制成1％的蛋白溶液，設(shè)定pH8，溫度50℃，分別在加酶量0.2×10⁴，0.3×10⁴，0.4×10⁴，0.5×10⁴，0.6×10⁴U／g的條件下酶解2h。

（4）響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)蛋白酶解工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、pH、加酶量、酶解時(shí)間4個(gè)因素為自變量，以曠淀粉酶活性抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法四因素三水平試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，按照BoX-Behnken原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

（5）數(shù)據(jù)處理

采用Orign8.5、DesignExpert8．0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

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