索馬甜(也譯作嗦嗎甜、莎馬甜，Thaumatin)又稱奇異果甜蛋白，是從天然植物Thaurnatococcusdaniellii中提取出的超甜蛋白質(zhì)，與其他植物來源的具有甜味或能誘發(fā)甜味的蛋白質(zhì)如莫內(nèi)林(Monellin)、仙茅蛋白(庫克靈，Curculin)161、馬檳榔蛋白(馬檳靈，Mabinlin)、神秘果素(Miraculin)、培它丁(Pentadin)191、布拉齊因(Brazzein)等一起被稱之為甜蛋白。相對于傳統(tǒng)的碳水化合物糖類或化學(xué)合成甜味劑，這些天然甜蛋白一般具有甜度高、熱量低、口感好、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，還具有改善食品風(fēng)味、可降解為人體所需的各種氨基酸以及不會引起血糖升高、蛀牙等特點(diǎn)，被認(rèn)為非常具有發(fā)展前景的食品添加劑。研究表明，索馬甜是由一個(gè)多基因家族編碼、具有相似性質(zhì)的蛋白，不同類型索馬甜蛋白均由一條多肽鏈組成，含有207個(gè)氨基酸，但僅有5個(gè)或更少的氨基酸差異，分子量約為22kD，等電點(diǎn)介于11.5～12.5之間，目前已發(fā)現(xiàn)的包括ThaumatinI、ThaumatinII、Thaumatina、Thaumatinb、ThaumatinC等，其中ThaumatinI和ThaumatinII是最主要的成分。索馬甜的甜度約是等質(zhì)量蔗糖的3000倍，此外，還具有增強(qiáng)芳香和改善風(fēng)味作用，與糖類等甜味劑共用有協(xié)同效應(yīng)。索馬甜產(chǎn)生甜味的機(jī)理與其結(jié)構(gòu)中的Lys殘基、羧基以及Asp-21和Phe-80形成的類天冬苯丙二肽酯位點(diǎn)等有密切關(guān)系。

目前，索馬甜作為甜味劑、增味劑，在歐美國家和日本具有一定的使用規(guī)模，國內(nèi)使用相對較少，根據(jù)我國現(xiàn)行的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-2014)，索馬甜可以作為甜味劑在冷凍飲品(食用冰除外)、加工堅(jiān)果與籽類、焙烤食品、餐桌甜味料、飲料類(包裝飲用水除外)食品中限量使用，其最大允許使用量均為0.025g／kg。但是，由于索馬甜的產(chǎn)量受制于資源、地域以及規(guī)模化生產(chǎn)條件，限制了其在食品加工中的使用，國內(nèi)外已有不少利用基因工程技術(shù)對其基因進(jìn)行克隆、通過蛋白表達(dá)的研究報(bào)道。

然而，國內(nèi)尚無針對索馬甜的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，對其檢測方法的報(bào)道也非常少，僅見方光偉等利用高效液相色譜一蒸發(fā)光檢測器針對包括索馬甜在內(nèi)的甜味劑檢測方法的研究。本文首次基于色譜法和電泳法建立飲料中索馬甜的分析測試方法，其中所用色譜法以DAD為檢測器較之通用型檢測器具有選擇性，可以起到一定的定性作用，此外，通過SDS-PAGE進(jìn)一步印證，對于較為復(fù)雜的食品基質(zhì)，能夠獲得更為可靠的結(jié)果。

一、儀器、試劑與方法

1、儀器與試劑

儀器設(shè)備：超高效液相色譜儀(1290)：美國Agilent公司；紫外可見分光光度計(jì)(Lambda35)：美國PerkinElmer公司；高速冷凍離心機(jī)(BiofugeStratos)：美國ThermoFisherScientific公司；Milli—Q超純水裝置：法國Millipore公司；電子天平(AL204／01)：METTLERTOLEDO公司；蛋白電泳系統(tǒng)Mini-PROTEINTetra：美國Bio-rad公司；超聲波清洗器(KQ5200DE)：昆山市超聲儀器有限公司；超濾管(15mL，10KD)：法國Millipom公司；0.45μm水系微孔濾膜購自上海安譜公司。

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑：索馬甜(純度97.8％)購自日本TOKYOCHEMICALINDUSTRY公司；蛋白標(biāo)樣(MidRange)：BBI生命科學(xué)有限公司；5X蛋白上樣緩沖液、甘氨酸、過硫酸銨、丙烯酰胺、N’，N’一甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、三氟乙酸：生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司；甲醇、乙醇、乙酸均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙腈：默克化工技術(shù)(上海)有限公司；試驗(yàn)所用不同種類飲料產(chǎn)品購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

2、方法

（1）樣品處理

飲料搖勻(其中碳酸類飲料提前超聲5min除去二氧化碳)，取2.5mL移入到25mL容量瓶中，用水定容，在4℃下以8000r／min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液15mL到超濾管中進(jìn)行超濾處理，輕輕沖洗濾膜，截留液定容至3mL，進(jìn)行色譜分析前用0.45μm濾頭過濾。

（2）紫外可見光譜掃描

以水為空白對照，對索馬甜水溶液進(jìn)行全波長掃描。掃描速度：120nm／min，分辨率：0.1nm，狹縫寬度：0.5nm，掃描范圍：700～190nm。

（3）液相色譜條件

色譜柱：300SB-C18，RRHD1.8μm，100mm×2.1mm(i，d)；流動相：乙腈、0.1％三氟乙酸水溶液；流速：O.3mL／min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃。梯度洗脫：0～3min，乙腈10％～0.1％三氟乙酸水溶液90％；3～15min，乙腈(10％～100％)，0.1％三氟乙酸水溶液(90％～0％)；15.1～20min，乙腈(100％)；20.1～25min，乙腈10％～0.1％三氟乙酸水溶液90％。檢測器：DAD，檢測波長278.2nm，同時(shí)進(jìn)行190～400nm波長掃描。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將索馬甜分別用水稀釋到濃度為10mg／L、25mg／L、50mg／L、100mg／L、200mg／L、500mg／L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行分析測定，以色譜峰面積與相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

(5)檢出限和定量限

將不含索馬甜的飲料稀釋10倍，加入索馬甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在10mg／L，飲料搖勻(其中碳酸類飲料提前超聲5min除去二氧化碳)，取2.5mL移入到25mL容量瓶中，用水定容，在4℃下以8000r／min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液15mL到超濾管中進(jìn)行超濾處理，輕輕沖洗濾膜，截留液定容至3mL，進(jìn)行色譜分析前用0.45pm濾頭過濾。重復(fù)測定20次，以結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算出方法的檢出限，以結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍計(jì)算出定量限。

(6)回收率和精密度

分別向不同類型飲料樣品中添加25mg／L、50mg／L、200mg／L不同濃度的索馬甜，每個(gè)加標(biāo)樣品按照所建立的方法重復(fù)測定6次，計(jì)算回收率和精密度。

(7)SDS—PAGE分析

分離膠濃度12.0％，電泳樣品用5X蛋白上樣緩沖液沸水處理5min，上樣量60μL，電泳條件135V、50min，考馬斯亮藍(lán)染色。

二、結(jié)果

1、超高效液相色譜法分析索馬甜方法的建立

（1）紫外可見光譜掃描結(jié)果

利用紫外可見分光光譜儀對索馬甜溶液在700～190nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，索馬甜具有蛋白質(zhì)類化合物典型的紫外可見光譜，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中芳香族氨墓酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的存在，使得其在280nm附近有特征吸收峰，在此區(qū)域最大吸收波長為278.2nm。雖然在200nm附近有更強(qiáng)的吸收，但由于大多數(shù)化合物在此區(qū)域有吸收，為避免干擾，選用278.2nm作為后續(xù)分析的依據(jù)。

（2）色譜條件及樣品處理?xiàng)l件的確定

考慮索馬甜蛋白質(zhì)分子量超過20000kD，具有較大的尺寸，故選用適合蛋白質(zhì)分析的大孔徑色譜柱，本研究采用300SB—C18，RRHD1.8μm。通過對常用的甲醇、乙腈等流動相進(jìn)行優(yōu)化，最終確立了以0.1％三氟乙酸、乙腈作為索馬甜液相分析的流動相。
 

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