（6）甘草渣總黃酮抗氧化能力測定

①甘草渣總黃酮對羥自由基（·OH）清除的測定甘草渣總黃酮對羥自由基（·0H）清除率按照Ren的方法進行實驗。取不同濃度的甘草渣總黃酮溶液1.0mL于試管中，分別加入1.0mL10mmol/LFeSO₄溶液和10mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻后加入1.0mL10mmol/LH₂O₂溶液，在37℃水浴條件下反應30min，在510nm波長處測定吸光度。使用蒸餾水替代H₂O₂作為參比對照，用蒸餾水代替樣品作為空白對照，計算羥自由基（·OH）清除率。另外取與提取液總黃酮同等濃度的維生素C溶液作為陽性對照。

式（2）中A₁為樣品溶液的吸光度；A₂為參比溶液吸光度；Ao為空白溶液的吸光度。

②甘草渣總黃酮對DPPH自由基清除能力的測定

對DPPH自由基清除能力采用Brand的方法進行測定。取1.0mL不同濃度的甘草渣總黃酮提取液于試管中，分別加入5mmol/LDPPH乙醇溶液1.0mL，混合均勻后暗室靜置30min，取2.0mL乙醇作為空白對照，1.0mL5mmol/LDPPH乙醇溶液與1.0mL乙醇混合液作為參比對照，于517nm波長處測定吸光度，按式（3）計算DPPH自由基清除率。另外取與提取液總黃酮同等濃度的維生素C溶液作為陽性對照。

式（3）中A₁為樣品溶液的吸光度；Ao為參比溶液的吸光度。

③甘草渣總黃酮總抗氧化能力測定

參考Oyaizu的方法對甘草渣總黃酮總抗氧化能力進行測定，維生素C溶液作為陽性對照。取不同濃度的甘草渣總黃酮溶液1.0mL于試管中，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0mL后混合均勻，50℃水浴反應20min后立即冷卻至室溫，加入2.0mL10%三氯乙酸終止反應。溶液在5000r/min條件下離心10min，取上清液2.0mL，再加入2.0mL蒸餾水和0.4mL0.1%FeCl₃溶液，混勻，暗室靜置反應30min后于700nm波長處測定吸光度。

（7）數(shù)據(jù)分析

用Origin9.0繪制數(shù)據(jù)圖，用Design-Expert8.0進行響應面試驗設計和分析，所有實驗均重復3次。

二、結果與分析

1、單因素實驗結果

（1）料液比對甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱取2.0g甘草渣，分別以料液比1:25（g:mL）、1:30（g：mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲30min，在60℃下回流提取2h方法進行實驗，結果如圖2所示。隨著溶劑用量的增多，總黃酮的收率呈先上升后下降的趨勢。當溶劑用量較少時，總黃酮的收率隨著溶劑用量的增多而升高，可能是由于溶劑的增加使得溶液與甘草渣能夠充分接觸，促進了黃酮的溶出，從而總黃酮收率也逐漸提高。當料液比為1:35時，總黃酮收率達到最大。而當料液比過大時，總黃酮收率下降，可能是由于料液比過高，造成雜質溶出過多，從而使總黃酮收率有所降低。另外，考慮到生產成本以及后續(xù)工作的工作量，選擇料液比為1:35。

（2）超聲時間對甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h中方法，固定其他條件，研究超聲時間對甘草渣總黃酮收率的影響。由圖3可知，當超聲時間在10min～40min之間時，甘草渣總黃酮收率隨著超聲時間的延長快速增加，可能是因為超聲作用使細胞破裂，促進總黃酮的溶出，從而提高其收率。當超聲時間達到50min時，總黃酮收率有所下降，可能是因為隨超聲時間的延長，細胞完全破裂，雜質溶出過多，使總黃酮的溶解量減少，也可能是因為超聲時間過長，破壞了總黃酮的結構，從而降低了總黃酮的收率。因而響應面優(yōu)化超聲時間條件水平選擇30min、40min和50min。

（3）提取時間對甘草渣總黃酮收率的影響

根據(jù)精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，在60℃下分別提取lh、2h、3h和4h實驗方法，固定其他條件，考察提取時間對總黃酮收率的影響，結果見圖4。可以看出，總黃酮收率隨著提取時間的增加呈先增大后平穩(wěn)的趨勢。當提取時間為2h時，總黃酮收率達到最大。之后再增加提取時間，總黃酮收率幾乎沒有變化。因而響應面優(yōu)化提取時間條件水平選擇lh、2h和3h。

（4）提取溫度對甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，分別在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h試驗方法對提取溫度對甘草渣總黃酮收率的影響進行研究，理論上黃酮類物質易溶于熱水，溫度越高，總黃酮收率應該越高。但研究結果并非如此，如圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮收率先增大后降低。當提取溫度達到70℃時，溫度達到最大，之后再增加提取溫度，總黃酮收率反而減小，這可能是由于溫度過高，黃酮類化合物較易分解，或者被氧化，導致其結構遭到破壞的緣故，也可能是因為溫度過高，溶劑揮發(fā)劇烈，導致有效溶劑相對減少，從而降低了總黃酮的收率。因而響應面優(yōu)化提取溫度條件水平選擇60℃、70℃和80℃。
 

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