7、體外模擬肽-鋅螯合物胃腸消化及鋅解離率測(cè)定

將制備的肽-鋅螯合物溶于pH2.0，37℃去離子水中，充分混勻后向其中添加2％(w/w)的胃蛋白酶，在37℃條件下水浴搖床酶解2h。水解液用分子截留量為500Da的透析袋透析5h，收集透析液，利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其中游離鋅的含量，評(píng)價(jià)肽-鋅螯合物在胃消化過程中的穩(wěn)定性，同時(shí)收集透析袋內(nèi)剩余物質(zhì)冷凍干燥備用。

將經(jīng)過胃蛋白酶消化后的肽-鋅螯合物溶于37℃，pH7．0的水溶液中，充分混勻后添加2％(w/w)的胰酶，在37℃條件下水浴搖床酶解3h。

隨后水解液用分子截留量為500Da的透析袋透析5h，收集透析液，利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其中游離鋅的含量，評(píng)價(jià)肽-鋅螯合物在腸消化過程中的穩(wěn)定性，同時(shí)收集透析袋內(nèi)剩余物質(zhì)冷凍干燥備用。

在模擬胃腸消化過程中，鋅的解離率定義為在胃腸消化過程中釋放游離鋅的量占消化前酪蛋白肽-鋅螯合物中鋅的總量的百分比。

8、肽-鋅螯合物中鋅的生物利用率

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含有10％胎牛血清，1％非必須氨基酸，100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃，相對(duì)濕度90％，CO₂濃度為5％。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中分布80％時(shí)，用含0.5％EDTA的胰酶消化細(xì)胞，然后以4-5×105cells/mL的濃度接種于6孔Transwell培養(yǎng)板中。

每隔2d換一次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞培養(yǎng)21d。然后棄去培養(yǎng)液，用HBSS清洗細(xì)胞2-3次，在細(xì)胞模型上側(cè)和下側(cè)分別添加1.5mL和3mLHBSS溶液。將經(jīng)胃腸消化后肽一鋅螯合物添加至上側(cè)，使其終濃度為1.5mg/mL，隨后將添加了樣品的Transwell培養(yǎng)板在37℃下吸收轉(zhuǎn)運(yùn)2h，收集培養(yǎng)板下側(cè)的溶液進(jìn)行透析，分別收集透析液和透析后的保留物，然后利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其中鋅的含量，與吸收之前比較，計(jì)算經(jīng)吸收過程后游離鋅的含量及螯合物中鋅的生物利用率。

9、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式。采用SPSS19.0(SPSSInc，Chicago，IL)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，利用Duncan檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)見的顯著性差異(α=0.05)。

三、結(jié)果與分析

1、酪蛋白肽的分離純化

酪蛋白水解物經(jīng)SephadexC25凝膠柱分離后的譜圖如圖1所示。由圖1可知，共分離得到4組酪蛋白肽組分，F(xiàn)1和F2組分是由流動(dòng)相20mM，pH4.0的醋酸緩沖液洗脫獲得；F3和F4組分是由流動(dòng)相20mM，pH4.0的醋酸緩沖液和0.5MNaCl共同洗脫獲得。本實(shí)驗(yàn)中分離酪蛋白肽采用的陽離子交換柱層析，以SPsephadexC-25作為固定相，其中以帶負(fù)電荷的磺酸基(一SO₃H)為主要功能團(tuán)，通過靜電相互作用對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。因此，F(xiàn)1和F2組分最先被洗脫下來，帶有較多的負(fù)電荷；F3和F4組分則帶有較多正電荷。由于F3和F4組分的洗脫液中含有NaCI，這兩組分需要經(jīng)過脫鹽處理。收集足夠量的肽組分后，調(diào)節(jié)pH為7.0，冷凍干燥后在一80℃條件下存放備用。

2、酪蛋白肽組分的ζ電勢(shì)

分離得到的4組酪蛋白組分的表面電荷性質(zhì)通過ζ電勢(shì)進(jìn)行確定。由圖2可知，從F1到F4組分的ζ電勢(shì)逐漸增加，分別為-43mV，-32mV，-11mV和3mV，且相互之間存在著顯著性差異(P＜0.05)。這一測(cè)定結(jié)果與上述酪蛋白肽組分的分離純化相符合，F(xiàn)1和F2組分帶有較多負(fù)電荷，ζ電勢(shì)較低；F3和F4組分最后從SPsephadexC-25陽離子交換填料上洗脫下來，所帶負(fù)電荷相對(duì)較少，因此ζ電勢(shì)較高。不同的ζ電勢(shì)表明酪蛋白肽組分在水溶液中穩(wěn)定性不同，同時(shí)也會(huì)影響肽與金屬離子之間的相互作用以及形成金屬螯合物的穩(wěn)定性。例如，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)由于含有較多帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，酪蛋白磷酸肽在pH變化的條件下仍然能夠與鐵形成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，由于ζ電勢(shì)的不同，本實(shí)驗(yàn)中分離得到的酪蛋白肽組分螯合鋅離子的能力以及形成肽鋅螯合物的穩(wěn)定性會(huì)存在較大的差異。

3、酪蛋白肽組分的氨基酸組成

活性肽的帶電性質(zhì)在宏觀上反映了其氨基酸組成的差異。帶有負(fù)電荷的組分含有相對(duì)較多的酸性氨基酸，而帶有正電荷的組分含有相對(duì)較多的堿性氨基酸。采用柱前衍生法對(duì)分離得到的酪蛋白肽組分的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。F1-F3組分中酸性氨基酸含量高于堿性氨墓酸含量。其中，F(xiàn)1組分中酸性氨基酸(Asp和Glu)含量占總氨基酸含量的42.64％；F2組分中酸性氨基酸含量占33.84％；F3組分中堿性氨基酸(His、Arg、Lys)含量明顯高于F1和F2組分，達(dá)到15.33％。因此，F(xiàn)1、F2和F3可看做帶負(fù)電荷的組分，掌電勢(shì)較低。F4組分中堿性氨基酸含量高于酸性氨基酸含量，堿性氨基酸占氨基酸總數(shù)的37.90％。F4為帶正電荷組分，亭電勢(shì)較高。此外，有研究報(bào)道，具有結(jié)合二價(jià)金屬離子能力的氨基酸殘基包括Asp、Glu、His、Ser、Cys、Asn和Gin，這些氨基酸殘基在4組酪蛋白肽組分中的含量分別為55.5％、40.4％、29.4％和26.1％。再結(jié)合氨基酸組成分析可知，分離得到的4組酪蛋白肽組分都可以螯合鋅離子，并且螯合鋅的能力從F1組分到F4組分逐漸減弱。

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