2.2　反硝化作用

參與氮循環(huán)反硝化作用的功能基因包括了硝酸鹽還原酶（narG）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/nirS）、一氧化氮還原酶（norB）、氧化亞氮還原酶（nosZ）等，分別負責催化NO₃-—NO₂-—NO—N₂O—N₂轉化。其中，nirK/nirS、nosZ是最常用于開展反硝化研究的主要分子標記基因。通過PCRDGGE技術和熒光定量PCR技術的分析，堆肥中各個時期普遍存在nirK/nirS、nosZ，而研究nirK/nirS在堆肥中反硝化作用的相對貢獻率，既是影響溫室氣體N₂O排放的重要因素，也是理解堆肥中氮素轉化機制的關鍵問題。有研究者在堆肥中添加生物炭，發(fā)現nirK基因豐度受到抑制，并且N₂O的排放顯著減少。新近研究結果則更加明確了nirK/nirS的相對貢獻率，通過采用選擇性抑制劑以及同位素比率法測定了牛糞堆肥中細菌nirK/nirS、真菌nirK的反硝化活性，從而明確了在牛糞堆肥過程中，細菌nirK的反硝化活性是N₂O排放的關鍵功能酶，但參與編碼nirK的反硝化細菌種類繁多，仍然需要進一步開展相關研究。而也有研究表明不同堆肥階段的narG，nirS和nosZ的基因表達與N₂排放顯著相關。因此，不同堆肥條件下，闡明參與反硝化作用的功能微生物群落結構及其如何影響N₂O排放，與堆肥環(huán)境因子的作用機制等仍是有待的深入探索。

2.3　厭氧氨氧化作用

厭氧氨氧化（AnaerobicAmmoniumOxidation,Anammox）則是繼硝化、反硝化后被發(fā)現的由微生物介導的氮素轉化過程，由于厭氧氨氧化過程與反硝化過程對NO₂的競爭作用會引起N₂O、N₂ 排放的差異，最終將影響堆肥過程的溫室氣體N₂O的排放。厭氧氨氧化細菌普遍存在于自然環(huán)境中，主要是在高氮、缺氧或好氧/缺氧的交界面環(huán)境條件中生存，在許多生態(tài)系統中是主要的氮損失途徑，不同生態(tài)系統中具有不同優(yōu)勢類群的厭氧氨氧化細菌，在堆肥體系中的研究則剛剛起步。

2.3.1厭氧氨氧化的關鍵酶基因分子標記研究　

參與Anammox過程的微生物組成、關鍵酶基因、生態(tài)分布等基因組學信息被科學家逐步認知，這主要依賴于分子標記手段進行研究。由于厭氧氨氧化細菌16SrRNA基因序列存在特異性不足的問題，研究者對參與Anammox過程關鍵功能酶及其編碼基因進行深入研究，這包括亞硝酸鹽還原酶（Nir），聯氨合成酶（HZS）和聯氨氧化酶（HZO）及其編碼基因（包括了nirS、nirK、hzs、hzo基因）可更好地應用于多樣性研究中。但不同功能基因在用于評估厭氧氨氧化細菌的多樣性和群落結構的研究中實際效果仍有不同。采用這些功能基因的研究仍處于初步的階段，研究發(fā)現nirS基因并非存在于所有厭氧氨氧化細菌，部分厭氧氨氧化細菌只檢測到了nirK基因。現有的研究結果顯示，nirS不適于單獨作為厭氧氨氧化細菌群落分析的特異性分子標記，而應用hzsA、hzsB、hzo基因獲得的分析結果與16SrRNA基因的研究結果具有較好的一致性，且hzs、hzo基因具有更高特異性。

2.3.2不同生境的厭氧氨氧化菌群結構及其環(huán)境影響因子　

目前，對厭氧氨氧化過程的研究主要集中在不同類型生境的細菌群落演化，包括海洋、淡水、陸地生態(tài)系統等。研究發(fā)現，CandidatusScalindua屬通常在海洋生態(tài)系統的高鹽度環(huán)境中占據絕對優(yōu)勢，河口生態(tài)系統中以Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia為主，污水廠、反應器等工程生態(tài)系統中以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Jettenia為主，農田土壤中則以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia為主。鹽分、氮素養(yǎng)分、溫度、溶解氧等均是影響厭氧氨氧化細菌群落結構的重要環(huán)境因子。Ca.Scalindua適應高鹽度的海洋環(huán)境主要是通過表達一種對NO^-₂、NH⁺₄具有高親和力的蛋白質。而Ca.Brocadia通常生長于淡
水生態(tài)環(huán)境且傾向于在高濃度的NO^-₂、NH⁺₄環(huán)境中占據優(yōu)勢。針對海洋生態(tài)系統的研究發(fā)現，NH⁺₄、NH⁺₄/∑（NO^-₃+NO^-₂）與厭氧氨氧化細菌多樣性正相關，而有機質含量則是負相關。

另外，厭氧氨氧化細菌可以在寬泛的溫度中生存，從高寒環(huán)境到深海熱液，群落結構也會隨著溫度變化而發(fā)生演化。Ca.Kuenenia對溫度變化具有很好的適應性，而Ca.Scalindua則能夠在80℃的環(huán)境中生存。

2.3.3好氧堆肥中厭氧氨氧化菌群研究　

在好氧堆肥過程中，由于存在著微環(huán)境局部厭氧條件，已有研究發(fā)現在牛糞堆肥過程中的檢測出厭氧氨氧化細菌，并研究了厭氧氨氧化細菌群落多樣性。研究者采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術對厭氧氨氧化細菌16SrRNA基因擴進行增，分析了牛糞堆肥過程中厭氧氨氧化細菌多樣性，結果顯示厭氧氨氧化細菌存在于整個堆肥過程，Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Scalindua3個屬為優(yōu)勢菌屬，且多樣性隨著不同堆肥階段變化，高溫期和降溫期的多樣性較高；與其他生態(tài)系統的研究結果不同的是，在堆肥高溫期的優(yōu)勢菌屬是Ca.Brocadia。而針對不同堆肥原料的好堆肥過程中，厭氧氨氧化細菌多樣性是否具有一致性，群落結構組成對堆肥環(huán)境條件異質性的響應，以及環(huán)境因子驅動厭氧氨氧化的作用機制等內容仍有待于進一步的開展。

3　好氧堆肥過程的硫素轉化

在硫素代謝方面，堆肥中惡臭硫氣體的排放，盡管排放通量較低，但其嗅閾值遠遠低于NH₃，成為限制堆肥技術發(fā)展的主要次生環(huán)境污染問題。硫素生物轉化過程（圖1）中，如硫化氫在好氧條件下可被硫氧化細菌氧化形成硫酸鹽，而在厭氧條件下硫酸鹽則被還原為H2S等惡臭硫氣硫氧化途徑，包括：（1）硫化物氧化途徑，黃素細胞色素c硫化氫脫氫酶（Fcc）、硫化物醌還原酶（Sqr）；（2）單質硫氧化途徑，異化亞硫酸鹽還原酶（Dsr）、類異二硫醚還原酶（Hdr）；（3）硫氧化酶復合體（Sox）等。Luo等對硫氧化酶系統（soxB）、硫化物醌還原酶（sqr）、異化亞硫酸還原酶（dsrA）編碼基因的高通量測序分析，揭示了珠江流域中的硫氧化優(yōu)勢種群以及功能基因的多樣性，表明硫氧化細菌在水體硫生物化學循環(huán)
發(fā)揮著重要作用。在硫氧化細菌中，硝酸鹽還原硫氧化細菌（Nitrate-reducing,sulfide-oxidizingbacteria,NR-SOB）是一類將硝酸鹽還原與硫化物氧化同時催化進行的細菌，NR-SOB的多樣性和分布特征是研究碳氮硫循環(huán)的重要菌群，可指導污水、黑臭水體、污泥治理等諸多氮硫轉化調控技術。

在好氧堆肥中的硫素轉化研究，主要集中在通過添加外源化合物、功能微生物調控堆肥過程，從而實現減少氮素損失和惡臭氣體排放。通過添加硫磺可以改善堆肥品質，減少氮素損失。最初，在堆肥中添加具備酸性化學特性的單質元素硫，有效降低了堆肥pH，更有利于堆肥產物的農田應用。進一步研究發(fā)現，在堆肥中添加硫磺和硫氧化細菌既降低堆肥pH，且顯著提高了堆肥中NH₄⁺、NO₃^-含量。由此可推測，堆肥中存在著氮硫相互作用，添加硫磺和硫氧化細菌不僅影響了堆肥pH，也影響了氮素轉化。利用硝酸鹽作為電子受體，對硫酸鹽還原起到競爭性抑制作用，在堆肥中添加硝酸鹽顯著降低惡臭硫氣體的產生。近年來，有學者通過添加外源七鉬酸銨和亞硝酸鹽到好氧堆肥中，有效降低惡臭硫氣體（二甲基硫、二甲基二硫）的排放量達92.3%和82.3%。目前，在好氧堆肥中的硫素轉化研究中，針對參與好氧堆肥過程中的硫素轉化的微生物多樣性以及群落結構等研究較少，對參與堆肥惡臭硫氣體轉化的功能微生物及其動態(tài)變化過程也知之甚少，仍有待于進一步開展相關研究工作，以闡明其相關的作用機理。

4　展望

長期以來，畜禽糞污綜合利用率低、好氧堆肥處理效率低，其核心問題即是由微生物驅動氮、硫物質轉化過程所引起的氮素流失及臭氣排放。得益于高通量測序等現代分子生物學技術，科學家可以深入的研究參與好氧堆肥過程的微生物群落特征以及功能微生物的分子機制。然而人們通常只針對某一類微生物、氮素或硫素單一的轉化過程開展獨立研究，如針對好氧堆肥工藝調控過程中的氮循環(huán)硝化、反硝化的功能微生物上的研究等。在現有的研究中，好氧堆肥微生物群落的動態(tài)變化及其時空異質性已取得初步的了解，這有助于我們增加對不同堆肥階段發(fā)揮主要作用的優(yōu)勢菌群的認知。同時，已有研究分析了厭氧氨氧化對局部生態(tài)系統中氮循環(huán)的貢獻率，但對于好氧堆肥中的厭氧氨氧化過程則知之甚少，僅有的研究證實了堆肥過程中存在厭氧氨氧化作用。在硫素轉化過程的研究中，也已證實了氮硫轉化的關聯性，但對堆肥過程中的氮硫相互作用機理則少有深入的研究，針對氮硫作用的研究主要集中在污水、黑臭水體、污泥治理等領域。

因此，在現有研究的基礎上，從不同堆肥物料的氮硫生物轉化過程出發(fā)，利用基因組學與理化分析相結合的技術手段，對畜禽糞污好氧堆肥工藝下的氮硫轉化動態(tài)、氣體排放規(guī)律、生物化學機理等進行深入研究，闡明相關功能微生物的群落特征及功能基因表達情況，既可以從微生物尺度提升對堆肥過程中物質轉化規(guī)律的認識，也有利于揭示整個堆肥過程中影響氮硫生物轉化的環(huán)境因子（圖1）。此外，可同時利用多組學、同位素標記技術等驗證各個氮硫生物轉化過程之間的耦合作用及相關功能微生物種群在物質循環(huán)中的貢獻率，為提升畜禽糞污高效生物轉化技術工藝、惡臭氣體減排提供堅實的科學基礎。

當前我國正處于農業(yè)轉型升級的關鍵時期，積極推進農業(yè)綠色發(fā)展，減少農藥、化肥使用量，促進農膜、秸稈、畜禽糞污等有機廢棄物資源循環(huán)再利用，是保護農業(yè)生態(tài)環(huán)境和生態(tài)文明建設的重要手段。據聯合國糧食及農業(yè)組織（FAO）的統計數據顯示，與2018年相比，到2030年我國畜禽糞污氮素排放總量將達到837萬t，增長44.7%。畜禽糞污既是污染物，也是寶貴的養(yǎng)分資源，針對畜禽糞污與日俱增的環(huán)境污染壓力，加強畜禽糞污生物轉化技術的研究與應用，促進好氧堆肥技術發(fā)展，使物質和能量得到高效的循環(huán)利用，減少廢棄物排放與化肥投入，有利于我國生態(tài)循環(huán)農業(yè)、農業(yè)現代化和可持續(xù)發(fā)展。

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