蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種兼性需氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽胞，廣泛分布于土壤、水、空氣和各類生熟食品中。食用了該菌污染的食品容易導(dǎo)致食物中毒，引起的食物中毒類型主要包括腹瀉型中毒和嘔吐型中毒，其中腹瀉型中毒主要與某些菌株分泌腸毒素相關(guān)，而嘔吐型中毒主要是由于某些菌株產(chǎn)生嘔吐毒素引起。

國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件。1950年在挪威發(fā)表了第一起蠟樣芽胞桿菌食物中毒的報(bào)告，之后許多國(guó)家，尤其是歐洲一些國(guó)家相繼報(bào)告了類似食物中毒的爆發(fā)。挪威和荷蘭將蠟樣芽胞桿菌認(rèn)定為食品中最易檢出的病原微生物。我國(guó)在上世紀(jì)70年代報(bào)道蠟樣芽胞桿菌中毒事件后，此類中毒事件的報(bào)道逐年增多。據(jù)2008~2015年我國(guó)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)資料顯示，微生物性食源性疾病占比39%，其中蠟樣芽胞桿菌引起的中毒事件占17%，在細(xì)菌性病原體中排在第三，危害極為嚴(yán)重。嘔吐型蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒時(shí)有發(fā)生，約占蠟樣芽胞桿菌食物中毒總數(shù)的75.9%。因此，建立一種快速、特異的方法檢測(cè)食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌至關(guān)重要。

目前檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的方法是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌（GB4789.14-2014），主要包括增菌、分離培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定、生化分型。對(duì)于分離的蠟樣芽胞桿菌主要是采用PCR或熒光定量PCR的方法鑒定其是否是嘔吐毒株（嘔吐毒素合成酶基因存在與否）。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新興的檢測(cè)技術(shù)，它以其特異性強(qiáng)、等溫靈敏、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)在食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。在食源性致病菌方面，目前已經(jīng)建立了副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、沙門(mén)氏菌（Salmonella spp.）、克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）和蠟樣芽胞桿菌等致病菌的LAMP技術(shù)，但沒(méi)有從蠟樣芽胞桿菌中區(qū)分出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的LAMP檢測(cè)方法報(bào)道。本研究旨在以產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌基因cesB為靶基因，設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)特異性引物，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，建立一種產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的特異快速檢測(cè)技術(shù)，為衛(wèi)生檢驗(yàn)和食品質(zhì)量安全提供技術(shù)保障，不斷提高我國(guó)食品安全與公共衛(wèi)生控制水平。

1材料與方法

1.1菌株

本試驗(yàn)收集菌株62株，所有菌株均由廣東省微生物研究所提供。

1.2培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨肉湯、LB肉湯等培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Bst DNA聚合酶：NEB公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，2×PCR Mix：廣州東盛生物科技有限公司；顯色劑：廣州迪奧生物科技有限公司；dNTPs，DNA Marker2000：生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和甜菜堿：Sigma公司。

1.3主要儀器

低溫高速離心機(jī)：SIGMA 3K30，德國(guó)sigma公司；酶標(biāo)儀：EPOCH2，美國(guó)BioTek公司；PCR儀：Mini3220，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電泳儀：DDR-6B，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：Tanon-4600SF，上海天能科技有限公司；移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱：SPX-150B-Z，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫水浴鍋：XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)

將菌株接種至在胰蛋白胨肉湯（TSB）培養(yǎng)，（36±1）℃培養(yǎng)16~18 h。

1.4.2 DNA抽提

試劑盒法：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。煮沸法：取1 mL菌液或樣品增菌液于12000 r/min離心5 min，棄上清。加入200μL無(wú)菌水洗滌1次后，用100μL TE懸浮混勻，于100℃水浴10 min，冰浴3 min，12000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.4.3引物設(shè)計(jì)

（1）LAMP引物設(shè)計(jì)：以產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌cesB為靶基因，設(shè)計(jì)LAMP引物，引物序列見(jiàn)表1，由上海生物工程公司合成。（2）PCR引物：參考文獻(xiàn)序列，由上海生物工程公司合成。

1.4.4 LAMP擴(kuò)增

LAMP反應(yīng)體系25μL，包括2.5μL10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.6 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L上游外引物F3、0.2μmol/L下游外引物B3、1.6μmol/L上游內(nèi)引物FIP、1.6μmol/L下游內(nèi)引物BIP、6 mmol/L MgSO4、1 mol/L甜菜堿、8 U Bst DNA聚合酶、3μL細(xì)菌DNA模板，加dd H2O至體積25μL，加入顯色劑在PCR管蓋。擴(kuò)增反應(yīng)條件：63℃恒溫水浴1 h，不用開(kāi)蓋，通過(guò)顏色直接觀察結(jié)果。

1.4.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序參考張志鴻等的報(bào)道。用1×TAE電泳緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠，上5μL，100 V電壓下30 min電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.4.6 LAMP特異性驗(yàn)證

將表2中所有菌株接種至TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液用煮沸法提取DNA，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)體系的特異性。

1.4.7 LAMP靈敏度評(píng)價(jià)

1.4.7.1基因組靈敏度

將產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液，用DNA抽提試劑盒抽提DNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定DNA濃度。將上述DNA進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的DNA靈敏度。

1.4.7.2純菌靈敏度

將產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液，進(jìn)行梯度稀釋，用DNA抽提試劑盒抽提不同稀釋度的DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的純菌靈敏度。同時(shí)對(duì)含不同稀釋度的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.4.8人工污染樣品檢測(cè)

稱取經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢驗(yàn)不含蠟樣芽胞桿菌的新鮮米飯樣品25 g至225 mL LB培養(yǎng)基中，接種計(jì)數(shù)的產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌F4810/72菌液，人工模擬樣品的最終濃度分別為100CFU/g、101CFU/g、102CFU/g和103CFU/g，37℃靜置培養(yǎng)，在0、2、4和6 h后分別從增菌培養(yǎng)基中取1 mL上清液于無(wú)菌離心管中，提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。同時(shí)對(duì)含不同稀釋度的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.4.9食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)

購(gòu)買各大超市和快餐店的食品72份，其中熟食24份，水產(chǎn)品24份，奶制品24份。每份樣品平均分成2份，一份按GB 4789.14-2014分離檢測(cè)；另一份直接用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，取1.5 mL增菌液按上述煮沸法提取DNA，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

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