曲霉型豆豉的生產(chǎn)可以追溯至戰(zhàn)國時(shí)代，在中國有著悠久的歷史。傳統(tǒng)曲霉型豆豉采用自然接種制曲，曲醅添加輔料后熟而成，具有營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)及保健功效。米曲霉作為曲霉型豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢微生物，其酶系豐富，可在豆豉制曲階段積累多種酶類，其中的蛋白酶系（酸性、中性、堿性）尤為重要，對豆豉的品質(zhì)起到?jīng)Q定性作用。而在豆豉制曲過程中，米曲霉主要產(chǎn)中性蛋白酶，其活性的高低決定了豆豉發(fā)酵成熟的周期和質(zhì)量，此酶可將大豆蛋白降解為多肽、游離氨基酸等，對豆豉的營養(yǎng)及風(fēng)味形成起到重大作用。

在工業(yè)化生產(chǎn)的背景下，采用純種發(fā)酵對我國豆豉企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有重要意義。而優(yōu)良的菌種除了產(chǎn)蛋白酶等酶系能力強(qiáng)，還應(yīng)該具備生長速率快、產(chǎn)孢子能力強(qiáng)等特點(diǎn)，產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的菌種更容易成為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，抑制其它菌種的生長和繁殖，減少雜菌污染，縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率。但天然菌株產(chǎn)酶能力較差，難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，因此科研工作者進(jìn)行了大量的菌種改良工作。夏楊振興通過對米曲霉中性蛋白酶I基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，對構(gòu)建好的畢赤酵母Gsll5基因工程菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)增加糖基化位點(diǎn)后的突變酶活力較野生型提高了11.5％

然而基因工程菌株在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用受到很大的限制，目前在米曲霉的育種方面依然采用的是經(jīng)典的物理化學(xué)誘變，而清華大學(xué)研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變技術(shù)作為一種新型的誘變技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的誘變手段，其具有基因損傷強(qiáng)度高、突變范圍廣、安全便捷的優(yōu)勢，顯著提升了菌株的突變率，近年來廣泛應(yīng)用于微生物育種領(lǐng)域。該技術(shù)的誘變原理基于大氣壓射頻輝光放電產(chǎn)生的等離子體（ARTP），等離子體產(chǎn)生的大量活性粒子與微生物細(xì)胞及周圍基質(zhì)作用，產(chǎn)生大量的活性氧、活性氮自由基，并改變細(xì)胞膜的通透性，這些活性粒子和氧化自由基進(jìn)入細(xì)胞，與DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子作用造成DNA的直接和間接損傷，引起細(xì)胞的SOS等多種保守和非保守的修復(fù)機(jī)制，從而引起高效突變。

曲霉型豆豉對感官品質(zhì)要求嚴(yán)格，對其組織形態(tài)要求顆粒完整、松散成型，因而其生產(chǎn)必須由整粒大豆經(jīng)蒸煮，之后發(fā)酵制成。由于物料的形態(tài)缺陷導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵過程中與微生物接觸空間有限及傳質(zhì)不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致了曲霉型豆豉了曲醅蛋白酶活力較低。因此本文利用ARTP誘變技術(shù)選育高產(chǎn)中性蛋白酶活力米曲霉菌株，并用整粒大豆制作復(fù)篩培養(yǎng)基進(jìn)行酶活驗(yàn)證，以期提升曲醅的中性蛋白酶活力，為曲霉型豆豉純種發(fā)酵奠定一定的理論基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1、菌株

米曲霉（Aspergillus oryzae）NCU一110：從日本醬油釀造用菌粉中分離而來，經(jīng)擎科生物測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對后，其同源性與Aspergillus oryzae isolate F8160（Accessionnumber：MN429212.1）高達(dá)99.64％，鑒定為米曲霉，該菌株具有蛋白酶系完整，以產(chǎn)中性蛋白酶為主的特點(diǎn)。目前由南昌大學(xué)中德食品工程中心保藏。

2、試劑與儀器

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、酪蛋白、三氯乙酸、福林酚試劑、酪氨酸、濃鹽酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；TGL一16B型高速離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技公司；

SP—756P紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；HWS—250恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海新苗實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

3、培養(yǎng)基

（1）菌種活化及保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；

（2）初篩培養(yǎng)基：干酪素4.009，磷酸二氫鉀0.369，磷酸氫二鈉1.079，氯化鋅0.049，氯化鈣0.0029，硫酸鎂0.59，氯化鈉0.169，硫酸亞鐵0.0029，胰蛋白胨0.03～0.059，瓊脂159，蒸餾水定容為lL，12l℃滅菌30min；

（3）復(fù)篩、制曲培養(yǎng)基：選取1509優(yōu)質(zhì)東北黃豆，清洗后用三倍體積的自來水于35℃浸泡3h，瀝干后，121℃滅菌30min；

（4）種曲培養(yǎng)基：麩皮、豆粕、水質(zhì)量比例為：80∶20∶80，500mL三角瓶裝量料509，水40mL，自然pH，121℃滅菌30min；

（5）察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3.09，磷酸氫二鉀1.09，氯化鉀0.59，硫酸鎂0.59，硫酸亞鐵0.019，蔗糖209，蒸餾水1L，將上述藥品按順序溶解后，加入209瓊脂加熱溶化，分裝后121℃滅菌30min。

4、 ARTP誘變

（1）米曲霉孢子懸浮液制備

取活化好的米曲霉NCU一110試管斜面，用無菌生理鹽水沖洗即得孢子懸液，取樣進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸液稀釋至106CFU/mL，備用。

（2） ARTP誘變條件的確定

采用氦氣為工作氣體，使載片與等離子體發(fā)生器射流出口間距約2mm，功率為120W，氣流量10L/min，對10μL孢子懸液進(jìn)行誘變處理，設(shè)置誘變時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度稀釋誘變后孢子懸液分別為4.0×10⁴CFU/mL、4.0×10³CFU/mL和4.0×10²CFU/mL，各取100μL涂布于初篩培養(yǎng)皿，30℃避光恒溫培養(yǎng)3d，計(jì)算致死率，繪制致死曲線圖。

致死率=（對照菌落數(shù)一誘變平板菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100％

5、高產(chǎn)中性蛋白酶活力菌株篩選

（1） 初篩方法

選擇最佳誘變時(shí)間下的孢子懸浮液，適當(dāng)稀釋（4.0×10²CFU/mL）后涂布于初篩培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h，觀察各個(gè)平皿中初篩菌株的透明圈和菌落大小，挑取菌落較大并且透明圈明顯的60株米曲霉（編號NCU—A1-A60）單菌落接種于PDA試管斜面，于30℃培養(yǎng)3～5d，待試管中突變米曲霉菌絲布滿黃綠色孢子，將60株米曲霉與原始菌株在初篩培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)種實(shí)驗(yàn)，計(jì)算K值并取K值較大的18株突變菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

K=透明圈直徑／菌落直徑，K值代表了菌株產(chǎn)蛋白酶的能力，可以用來判斷突變株產(chǎn)生蛋白酶活力的大小。

（2）淺盤制曲復(fù)篩高產(chǎn)中性蛋白酶活力突變株

將K值較大的18株初篩菌株活化，制備孢子懸液并稀釋至107CFU/mL。根據(jù)曲霉型豆豉淺盤制曲工藝，按照1.0％的接種量，前期發(fā)酵溫度控制在30～34℃，制曲至第18～24h，豆粒表面布滿白色菌絲，進(jìn)行第一次翻曲；當(dāng)曲醅出現(xiàn)嫩黃孢子時(shí)，進(jìn)行第二次翻曲，溫度控制在28～32℃。培養(yǎng)至72h取樣，采用SB/T 10317—1999中的福林酚法測定各菌株曲醅中性蛋白酶活力。

6、突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩得到的數(shù)株中性蛋白酶活力顯著提高的突變株和原始菌株在PDA試管斜面上30℃連續(xù)傳代9次，對上述菌株第1～9代豆豉曲醅的中性蛋白酶活力進(jìn)行測定，檢測復(fù)篩菌株的遺傳穩(wěn)定性。

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