7、突變株與原始菌株的生長性能及產(chǎn)蛋白酶系活力對比實(shí)驗(yàn)。

（1）菌落形態(tài)對比實(shí)驗(yàn)

取活化好的突變株和原始菌株試管斜面，分別用牙簽點(diǎn)種于PDA培養(yǎng)皿中心，30℃靜置培養(yǎng)，每隔24h觀察菌落形態(tài)變化，在無菌室超凈工作臺拍照記錄。

（2）微觀形態(tài)對比實(shí)驗(yàn)

采用載玻片培養(yǎng)觀察法，在培養(yǎng)期間每隔12h取出突變株與原始菌株載玻片，置于顯微鏡下觀察并對兩者的微觀形態(tài)進(jìn)行比較。

（3）產(chǎn)孢子能力對比實(shí)驗(yàn)

孢子含量測定參照種曲孢子數(shù)測定法。取活化好的突變株和原始菌株的孢子懸浮液（10，CFU/mL）按1.0％接種于種曲培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在32℃的培養(yǎng)箱中堆積培養(yǎng)。培養(yǎng)至15h后，將曲料打散進(jìn)行第一次搖瓶，并降溫至30℃平鋪培養(yǎng)。大約22h后，將曲料打散后接著平鋪培養(yǎng)，期間在第36、48、60、72和84h進(jìn)行取樣，測定兩者孢子含量。

（4）蛋白酶系活力對比實(shí)驗(yàn)

淺盤制曲將K值較大的18株初篩菌株活化，制備孢子懸液并稀釋至107CFU/mL。根據(jù)曲霉型豆豉淺盤制曲工藝，按照1.0％的接種量，前期發(fā)酵溫度控制在30～34℃，制曲至第18～24h，豆粒表面布滿白色菌絲，進(jìn)行第一次翻曲；當(dāng)曲醅出現(xiàn)嫩黃孢子時(shí)，進(jìn)行第二次翻曲，溫度控制在28～32℃。培養(yǎng)至72h取樣，采用SB/T 10317—1999中的福林酚法測定各菌株曲醅中性蛋白酶活力。突變株和原始菌株制曲期間，在第24、36、48、60、72和84h進(jìn)行取樣，蛋白酶活力（中性、堿性及酸性蛋白酶）測定采用SB/T 10317一1999中的福林酚法測定各菌株曲醅中性蛋白酶活力。

8、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行基本處理，并用SPSS 20.0軟件的0ne—Way ANOVA對其顯著性進(jìn)行分析；用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

二、結(jié)果與分析

1、米曲霉致死率曲線繪制

由圖1可知，隨著ARTP誘變時(shí)間的延長，其所產(chǎn)生的損傷作用可使菌體致死率不斷升高，在0～1min菌體致死率上升明顯，2～7min上升幅度不斷減小，7min以后致死率接近100％，本實(shí)驗(yàn)致死曲線的整體走勢與zhangN、司曉光報(bào)道的“馬鞍型”存活曲線非常吻合。當(dāng)處理時(shí)間為3min時(shí)，“馬鞍型”致死曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)的原因可能是誘變時(shí)間的增加導(dǎo)致ARTP對DNA的損傷作用加強(qiáng)，促使菌體啟動SOS修復(fù)機(jī)制，其誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA聚合酶IV和V對DNA鏈損傷部位的堿基錯(cuò)配不具備校正功能，SOS不精確修復(fù)觸發(fā)菌體生物反應(yīng)細(xì)胞中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，造成遺傳物質(zhì)及代謝途徑的改變，以此來應(yīng)對ARTP損傷刺激，菌體致死率下降。但當(dāng)損傷強(qiáng)度超過菌體修復(fù)機(jī)制的極限時(shí)，菌體便會大量死亡，因此7min以后菌體致死率接近100％。

高獻(xiàn)禮等人研究表明，ARTP誘變在致死率接近90％的條件下，可獲取較高的正突變率，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇6min為最佳誘變時(shí)間，此時(shí)致死率為91.05％。

2、初篩結(jié)果

點(diǎn)種在于考察優(yōu)良菌株是否能在密集的培養(yǎng)中仍能維持較高的中性蛋白酶活力，并且要求菌株的生長速率快，對環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)。菌株正突變表現(xiàn)為菌落長勢好并且K值比對照值大。由表1可知，18株初篩菌株的K值均大于原始菌株，其產(chǎn)中性蛋白酶能力可能優(yōu)于原始菌株，其中菌株NCU—A38、NCU—A55、NCu—A17菌落長勢較好，且透明圈直徑最大，分別為25．6、23.5、23.5mm，而它們的K值則分別達(dá)到了2.08、2.04、1.77。袁艷玲研究表明，依據(jù)K值篩選正突變株效率高，但菌株的產(chǎn)中性蛋白酶能力與K值并不是呈規(guī)律的線性相關(guān)。因而需要進(jìn)一步的復(fù)篩來確定最終高產(chǎn)中性蛋白酶活的突變株，實(shí)驗(yàn)采用淺盤制曲測定中性蛋白酶活予以驗(yàn)證。

3、復(fù)篩結(jié)果

上圖結(jié)合表1可以看出，原始菌株和18株初篩菌株中性蛋白酶活力大小與K值的關(guān)系：總體上，酶活力隨K值的增大而增大，比如突變株NCU—A38、NCU A55、NCU—A17的K值較大，并且其酶活也顯著高于其他菌株（JP＜0.05）。其中突變株NCU—A38中性蛋白酶活力最高，為765.4U/g，提高了25.0％，突變株NCU—A55、NCU—A17酶活也分別提高了21.0％、17.0％，效果顯著。但有些K值較大的菌株比如NCU—A9、NCU—A21，中性蛋白酶活力并不高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李鵬等人采用紫外誘變選育氨肽酶高產(chǎn)菌株的研究結(jié)果大體相同，有些初篩K值較大的菌株在經(jīng)復(fù)篩后其酶活性反而不高，由此這也說明了復(fù)篩的必要性。根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，選取NCU—A17、NCU—A38、NCU—A55三株中性蛋白酶活力顯著提高的突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定出性狀優(yōu)良的菌株。

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