一、前言

赤蘚糖醇是一種四碳糖醇，是目前唯一通過發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)的“零熱量”糖醇類甜味劑1990年，日本食品法規(guī)批準(zhǔn)赤蘚糖醇作為直接食品配料；1997年美國食品藥品監(jiān)督管理局將赤蘚糖醇列入GRAS（Generally Recognized as Safe）清單，允許在標(biāo)簽上標(biāo)注“有益于牙齒健康”，1999年6月，世界糧農(nóng)組織（JECFA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）聯(lián)合組成的食品添加劑專家委員會（FAO）批準(zhǔn)赤蘚糖醇作為食用甜味劑，無需規(guī)定每日允許攝入量（ADIh1999年11月，澳大利亞和新西蘭食品監(jiān)督局（ANZFA）批準(zhǔn)赤蘚糖醇作為食用配料《我國衛(wèi)生部2007年12號公告，批準(zhǔn)赤蘚糖醇為食品添加劑。為控制肥胖，減少人們對糖的攝人，2016年10月11日，世衛(wèi)組織呼吁各成員國及地區(qū)針對糖飲料產(chǎn)品加征稅費，這也促進(jìn)了人們對赤蘚糖醇的認(rèn)識。作為一種“零熱量”天然健康甜味劑，赤蘚糖醇越來越受到食品飲料制造商和消費者的青睞。

亞羅解脂酵母（Yarrowia lipolytica）與釀酒酵母親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的非常規(guī)酵母，有6條染色體和一條線粒體DNA。它作為食品安全菌，已通過美國食品藥品監(jiān)督管理局的GRAS(Generally Recognized as Safe）認(rèn)證。作為有潛力的工業(yè)微生物，近年來被用作宿主生產(chǎn)油脂、a-酮戊二酸以及番茄紅素等多種產(chǎn)品或天然化合物?，F(xiàn)有利用亞羅解脂酵母生產(chǎn)赤蘚糖醉的報道，多是從菌種選育或途徑改造方面進(jìn)行研究，從基因組層面分析赤蘚糖醇合成代謝的研究還十分匱乏。代謝產(chǎn)物的積累不僅和直接代謝途徑相關(guān)，與細(xì)胞全局變化也是分不開的，這也是基因組重排（GenomeShuffling）等技術(shù)能成功用于目標(biāo)菌株選育的原因，所以從基因組角度進(jìn)行全局分析也是十分必要的。

Yarrowia lipolylica BBE—17是一株可積累赤蘚糖醉的酵母，具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)赤蘚糖醇的潛力。本文以模式菌株Yarrowia lipolytica CLIB122為對照，從弟核苷酸多態(tài)性（SNP）、小片段插入和缺失（InDel）、基因組結(jié)構(gòu)變異（CV）、DNA拷貝數(shù)變異（CNV）、赤蘚糖醉途徑基因的分析等多個方面進(jìn)行比較基因組分析，全面闡述了Yarrowia lipolica BBE-17與模式菌株基因組的差異情況，為進(jìn)一步優(yōu)化亞羅解脂酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇提供了思路和理論依據(jù)。

二、材料與方法

1、菌株與培養(yǎng)基

Yarrowia lipolytica BBE-17，江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室自有菌株。YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，固體培養(yǎng)基再添加20g/L的瓊脂粉。菌株培養(yǎng)：挑取一環(huán)—800C保存的甘油管菌株，接種在裝有2mLYPD培養(yǎng)基的搖管中，300C培養(yǎng)20h，用移液槍吸取lmL菌液轉(zhuǎn)接至裝有50mLYPD培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，培養(yǎng)20h，5000r/min離心5min，棄上清，收集菌體，用于基因組提取。

2、基因組提取與測序

基因組提取參照試劑盒廠家提供的說明書，釆用的試劑盒為：高效植物基因組DNA提取試劑盒DP350，批號DP150906，天根生化科技（北京）有限公司。具體方法為：將通過2.1收集的亞羅解脂酵母菌體裝在50mL離心管中置于液氮中快速冷凍，然后將菌體取出，用研缽快速研磨，研磨過程始終保持有液氮對菌體進(jìn)行保護(hù)。研磨5min后，取丨OOpL菌體置于1.5mL離心管中，接下來按照試劑盒DP350說明進(jìn)行操作。在對吸附柱上的基因組DNA進(jìn)行洗脫時，采用的是30PL雙蒸水。提取的基因組DNA快速放在液M下冷凍保存，防止降解。

3、比較基因組分析

測序儀Reads覆蓋度分析：使用BWA軟件把Reads比對到參考序列上，并使用SAMTOOLS軟件對比對結(jié)果進(jìn)行解析，統(tǒng)計Reads對參考序列的覆蓋度。單核苷酸多態(tài)性與小片段插入缺失分析（SNP/InDel）：采用SAMTOOLS軟件進(jìn)行檢測，并分析SNP/InDe丨在基因組功能區(qū)域上的變異情況。結(jié)構(gòu)變異分析（SV）：利用BreakDancerM軟件檢測樣品與參考基因組間的插入（INS）、缺失（DEL）、倒罝（INV）、染色體內(nèi)部遷移（ITX）、染色體間的遷移（CTX）。DNA拷貝數(shù)變異分析（CNV）：使用CNVnator軟件檢測樣品與參考基因組間的序列拷貝數(shù)變異。全基因組變異圖譜分析（WGMP）：結(jié)合每個樣品的測序Reads對參考序列的覆蓋情況和SNP、InDel的分析結(jié)果，以參考序列為標(biāo)尺，使用Circos軟件把Reads薄蓋情況和SNP、InDel的分布情況展示到環(huán)形的變異圖譜上。

三、結(jié)果

1、高通置測序儀Reads與參考基因組的比對情況

參考基因組釆用的是Dujon等人公布的Yarrowia lipolytica CLIB122基因組數(shù)據(jù)（GenBank：GCA_000002525.1），經(jīng)比對分析確認(rèn)，樣品基因組的Reads的平均深度為68（圖1），其中Reads深度大于10的占98.67%（圖2）。從測序Reads的質(zhì)量來看，滿足比較基因組測定要求，可用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

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