1.3.5 結合常數(shù)和結合位點數(shù)的計算

結合常數(shù)結合位點通過以下方程描述：

式（6）中：Ka—梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結合常數(shù)；n—結合位點數(shù)。

1.3.6 熱力學參數(shù)評價

小分子與生物大分子之間可通過疏水鍵、靜電引力、范德華力和氫鍵等發(fā)生相互作用。熱力學參數(shù)焓變ΔH和熵變ΔS可根據(jù)Van’tHoff方程確定：

式（7）中：R—大氣常數(shù)，其值為8.314J/（mol·K）；T—反應溫度（303和310K）；Ka—結合常數(shù)。自由能ΔG由下式計算：

ΔG=ΔH-TΔS           （8）

ΔH和ΔS的值由lnKa對1/T的線性圖的斜率和截距計算。

1.3.7 梔子黃與淀粉消化酶相互作用的結合距離

以水為參比，在300～500nm波長范圍內(nèi)掃描梔子黃的紫外光譜，并根據(jù)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光光譜和梔子黃的紫外吸收光譜的重疊圖譜計算結合距離。熒光共振能量轉移（FRET）是一種距離依賴的相互作用，它是由供體分子（蛋白質）向受體分子（藥物）非輻射傳遞的激發(fā)能。能量傳遞效率可以用來評價配體與蛋白質中色氨酸殘基之間的距離。

非輻射能量轉移將發(fā)生在供體（α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶）和受體梔子黃之間，而條件是（a）供體可產(chǎn)生熒光；（b）供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有部分重疊；（c）供體和受體之間的距離約小于8nm。根據(jù)F觟rster非輻射能量轉移理論，能量轉移效率（E）不僅與受體和供體之間的距離（r）有關，而且與臨界能量轉移距離（R0）有關，即：

式（9）中：R₀—轉移效率為50%時的臨界距離，nm；r—受體與供體之間的距離，nm。

式（10）中：K²—供體與受體各項隨機分布的空間取向因子；N—介質的折射率；φ—不存在受體的情況下供體熒光量子產(chǎn)率；J—供體熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間的重疊積分；其計算公式如下：

式（11）中：F（λ）—熒光供體在波長λ的熒光強度；ε（λ）—受體在波長λ下的摩爾吸光系數(shù)。能量轉移效率E計算公式為：

式中：F₀和F與方程式（5）中的相同。

1.3.8 統(tǒng)計分析

使用origin2017作圖，使用SPSS21統(tǒng)計軟件包分析所有數(shù)據(jù)，結果表示為平均值±標準偏差（n=3）。P＜0.05被認為是顯著差異。

2 結果與討論

2.1 抑制動力學研究

本研究用淀粉和pNPG作為底物得到α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的Lineweaver-Burk圖，并確定其抑制類型，結果見圖1和表1。對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶來說最大速度（V_max）值為0.52和3.11×10^-2mg/（mL·min）保持不變，不同濃度的梔子黃存在均使米氏常數(shù)（Km）增加表明：梔子黃在兩種酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）分子上與酶底物結合位點競爭結合并形成復合物，繼而通過減少底物與酶的結合來降低酶促速率。即梔子黃與α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的活性中心結合，從而產(chǎn)生對酶蛋白活性的影響。這與多酚類物質抑制淀粉消化酶類似。競爭性抑制常數(shù)K_ic是抑制劑-酶復合物的解離常數(shù)，因此，1/K_ic代表抑制劑與酶的締合常數(shù)；K_ic值較低意味著抑制劑與酶活性位點的結合親和力較高。梔子黃對α-淀粉酶的K_ic（1.47）大于α-葡萄糖苷酶K_ic（0.58），意味著梔子黃對α-葡萄糖苷酶的結合親和力更高。

2.2 熒光光譜分析

圖2、圖3反映了不同濃度的梔子黃在不同溫度下對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間的熒光光譜圖。隨著梔子黃濃度的增大，α-淀粉酶和α葡萄糖苷酶的熒光強度呈現(xiàn)不同程度的降低，即熒光猝滅現(xiàn)象。此外，圖2和圖3發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射峰所處的波長發(fā)生紅移，說明梔子黃與兩種淀粉消化酶發(fā)生相互作用。為了闡述作用機制，使用Stern-Volmer方程分析熒光數(shù)據(jù)。

圖4的Stern-Volmer圖可以看到梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer的曲線是向y軸彎曲的曲線。熒光測量提供了有關發(fā)色團分子附近分子環(huán)境的信息。蛋白質熒光強度的降低稱為蛋白質熒光猝滅，這種猝滅可通過不同的機制，碰撞猝滅（動態(tài)猝滅）是激發(fā)態(tài)熒光團與溶液中的其它分子（猝滅劑）接觸而失活時發(fā)生。靜態(tài)猝滅為熒光團與猝滅劑形成非熒光配合物。線性Stern-Volmer曲線表明蛋白質中有一類熒光團以相同的方式與淬滅劑相互作用，并且只有一種淬滅機制（動態(tài)或靜態(tài)）發(fā)生。然而，當淬滅程度較大時，經(jīng)常觀察到方程的正偏差。在這種情況下，F(xiàn)0/F與[Q]描述了一條向上的曲線，向y軸凹陷。通常，向上彎曲表明有幾種機制負責蛋白質中熒光團的猝滅效應（既有動態(tài)猝滅又有靜態(tài)猝滅），或者它表明存在“作用域”（作用范圍），即表觀靜態(tài)猝滅。描述這種情況的Stern-Volmer方程的修改形式如下：

將此方程兩邊取自然對數(shù)，作ln（F₀/F）與[Q]的圖，得到一條直線，該直線斜率即為表觀靜態(tài)常數(shù)KSV即：

生物高聚物在不同的猝滅劑最大動態(tài)猝滅常數(shù)是2×10¹⁰mol^-1s^-1，表2中梔子黃對α-淀粉酶的猝滅常數(shù)（1.40×10¹¹mol^-1s^-1/1.26×10¹¹mol^-1s^-1）和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)（2.92×10¹¹mol^-1s^-1/5.10×10¹¹mol^-1s^-1）遠大于2×10¹⁰mol^-1s^-1，說明了猝滅方式是靜態(tài)猝滅為主，此外，猝滅常數(shù)反映了猝滅劑與生物高聚物的親和性，α-葡萄糖苷酶的猝滅常數(shù)大于α-淀粉酶，說明梔子黃對α-葡萄糖苷酶有更好的親和力。也印證了2.1節(jié)抑制動力學上梔子黃對α-葡萄糖苷酶有著更好的抑制作用。

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